结构生物学论文

本科生课程论文论文题目结构生物学研究方法之X射线晶体学技术创新完成时间2016年1月2日课程名称结构生物学任课老师祁超专业生物技术年级2012级姓名学号成绩评卷人结构生物学研究方法之X射线晶体学技术创新摘要：X射线晶体学技术在结构生物学中有着重要的应用，而X射线晶体学技术的创新将进一步推动结构生物学的发展。近年来通过对MAD和SAD方法的挖掘与改进，使得基于天然生物大分子异常衍射的结构解析成为可能。改进的X射线自由电子激光（FEL）装置在室温下可以更好地捕捉自然环境中的蛋白质构象；同时来自X-射线自由电子激光器的极短的、强烈的X-射线脉冲，可被用来在晶体的辐射损伤发生之前获得关于纳米到微米大小的蛋白晶体的数据，这种方法（被称为“序列飞秒晶体学”方法）将能产生不会形成宏观的、非常有序的晶体的蛋白和蛋白复合物的结构。以下将就相关技术进行讲解。关键词：X射线、创新、SAD引言：结构生物学是通过研究生物大分子的结构与运动来阐明生命现象的科学。药物设计、疫苗开发和蛋白质分子性能改等应用领域都以结构生物学的研究成果为基础。结构生物学的起源可以追溯到上世纪50年代Waston和Crick等发现DNA双螺旋结构，60年代Perutz和Kendrew利用X-射线晶体衍射技术获得肌球蛋白的三维结构，这些工作开创了结构生物学研究领域。半个多世纪过去了，随着技术的进步，结构生物学研究取得了巨大的发展，在近年来的分子生物学研究中占据了主流地位，并且逐渐成为生命科学研究的重要组成部分[1]。X射线具有良好的穿透性，是生物学领域的一种重要成像工具[2-5]。近几十年来，X射线晶体学与生命科学充分融合，并且充分吸收包括核磁共振（NMR）、电镜技术等在内的各种研究生物结构的技术方法，形成了以X射线晶体学为核心的结构生物学，为认识生物分子的三维结构和功能机制，提供了关键的信息，也因此而成为国际生命科学领域的热点研究方向。特别是近年来，包括三代同步辐射光源、X射线自由电子激光（XFEL）、新一代电镜技术在内的各种前沿技术的发展，X射线晶体学和结构生物学都迈向了一个新的历史发展阶段[6]。1、X射线晶体学技术简介X射线晶体学是一门利用X射线来研究晶体中原子排列的学科。更准确地说，利用电子对X射线的散射作用，X射线晶体学可以获得晶体中电子密度的分布情况，再从中分析获得原子的位置信息，即晶体结构。（以下论述以高分子材料的X射线晶体学为主）由于所有的原子都含有电子，并且X射线的波长范围为0.001－10纳米（即0.01－100埃），其波长与成键原子之间的距离（1－2埃附近）可比，因此X射线可用于研究各类分子的结构。但是，到目前为止还不能用X射线对单个的分子成像，因为没有X射线透镜可以聚焦X射线，而且X射线对单个分子的衍射能力非常弱，无法被探测。而晶体（一般为单晶）中含有数量巨大的方位相同的分子，X射线对这些分子的衍射叠加在一起就能够产生足以被探测的信号。从这个意义上说，晶体就是一个X射线的信号放大器。X射线晶体学将X射线与晶体学联系在一起，从而可以对各类晶体结构进行研究，特别是蛋白质晶体结构。2、X射线技术创新相关文献讲解2.1文献一：StructuresfromAnomalousDiffractionofNativeBiologicalMacromolecules基于天然生物大分子异常衍射的结构解析（详述）[7]利用同步加速器X射线光束(synchrotronx-raybeam)来解析蛋白和其他生物大分子的结构在医学上取得很大进步。科学家们获得的技术进步能够导致他们取得更加激动人心的进步。最近，来自美国国家同步幅射光源(NationalSynchrotronLightSource,NSLS)和纽约结构生物学中心和哥伦比亚大学的研究人员发现一种新方法来确定通过其他方法很难或者不可能解析的分子结构。他们的研究发表在《科学》期刊上。2.1.1.1结构解析的相位问题利用大分子X射线晶体学确定蛋白结构的过程必须要首先培养纯的分子晶体。当靶分子拥有足够的结构类似物时，这种过程更加容易。但是当靶分子没有结构类似物时，科学家们面临着“相位问题”，即缺乏描述入射X射线光波“相位”的关键性信息。当一个检测器记录X射线衍射图时，它能够检测强度，但是不能检测相位，但是没有相位时，分子结构就不能被完全解析出。2.1.1.2解决相位的原始方法当不存在相关的结构时，有两种其他的方法来评估相位。这些方法当中有两种方法都是属关于X射线晶体技术的：多波长异常衍射(multi-wavelengthanomalousdiffraction,MAD)，它利用多种波长的X射线；单波长异常衍射(single-wavelengthanomalousdiffraction,SAD)，它只利用一个波长的X射线。这两种技术通常都涉及加入硒到晶格(通过氨基酸衍生物硒代蛋氨酸，它容易整合进蛋白)之中，和扫描硒原子整个边上的X射线光束。硒是一种比在蛋白中通常发现的那些原子---比如碳、氮和氧---都要重，它吸收X射线，而且通过元素特异性共振再次发射X射线。根据这种共振衍射数据，科学家们能够确定相位。2.1.1.3解决相位的新方法在这项新研究中，研究人员开发一种方法来解决相位问题，而不用加入一种重元素到晶体之中，从而能够利用处于自然状态的蛋白开展研究。他们使用来自蛋白自己的硫原子的非共振散射(off-resonancescattering)，其中硫原子要比硒原子薄弱得多，但是也足够强大而能够发挥作用。他们利用低于正常的X射线能量而将SAD应用到几个晶体(对研究的每个蛋白而言，是5到13个晶体)，然后将相对弱的衍射信号结合在一起。2.1.1.4新方法简介硫是大多数天然蛋白质中最重的元素（Z=16）。其K层在2.47千电子伏（λ=5.02埃）发生共振无法达标准的MAD实验的标准，其异常衍射在常规波长是轻微;然而，硫的异常衍射足以满足SAD实验。第一个根据硫的SAD实验确定结构的蛋白质是Crambin，后来，在溶菌酶和在解决螅蛋白的结构的测试中证明了基于硫的SAD实验有更广泛的有效性。同样基于磷的SAD实验被证明可适用于核酸。真正常规天然的SAD实验的动机是伟大的，因为重原子的参入往往有问题的，即使是最可靠的硒代蛋氨酸。而使用大分子中天然的硫与磷就不会存在这种问题。2.1.2实验内容他们解析的4种蛋白在大小上存在差异，而且和它们含有不同的硫含量(每个分子拥有3到28个硫位点)。我们通过确定4种蛋白质晶体结构来建立多重结晶天然SAD实验步骤;在这些实际使用中解决了三个没有已知同源结构类似物的蛋白质结构（HK9S，CysZ，和netrinG2）和一个之前被其他方法解构的蛋白质（TorT/TorSs）挑战性测试的结构“再解决”。其中（CysZ）是一种完整的膜蛋白，其它的都是膜受体的结构域。四个测定的蛋白质晶体结构以下为带状图表所示。包括在SAD中分析中使用和确定的硫，氯，钙，和硫酸等亚结构。2.1.3新方法的实用性这些分子结构的范围从127到1148残基，晶体对称性从单斜到四方，并具有分辨率极限从2.8到2.3埃。每个结构之前都是未知的;HK9S和G2对其他结构测定方法都有抵抗;CysZ是新发现的一种膜蛋白;而TorT/TorSS复合体比较大但也在在适和的分辨率（2.8）。TorT/TorSS复合体结构鉴定的复杂性已超过PDB中现有的90%的蛋白质。这些应用的范围表示本方法具有实质通用性和稳健性。他们成功地解析出每个蛋白的结构提示着他们的研究为在大分子晶体学取得潜在大量的新发现打开新的大门。2.1.4扩展：MAD方法与SAD方法的比较MAD方法利用重原子尤其是Se（硒）在不波长的异常散射信号的差异计算衍射相位。一般要在表达蛋白阶段将Met（甲硫氨酸）中的S（硫）原子置换为Se，制备含有Se原子的蛋白样品并且得到晶体，而且通常需要光源的波长是可调的，这正好符合同步辐射光源特性。用此方法完成蛋白质结构解析必须收集不同波长下的多套衍射数据。SAD方法也是利用重原子提供的反常散射信息来计算衍射相位，与MAD相比，利用SAD法只需要收集一套数据，但是SAD方法对数据质量、冗余度等要求比较高。在获得重原子方面，除非起始天然蛋白质中含有重原子，一般需要通过晶体浸泡、共结晶等方式引入重原子。此外，由于天然蛋白质里多含有S原子，而且S在Cu（铜）靶（波长1.542）或Cr（铬）靶（波长2.29）室内常规光源下有一定的异常散射信号，所以可利用S原子作为异常散射源在室内光源条件下进行晶体结构解析工作。2．2文献二Nature：获得微小蛋白晶体结构的一种新方法DenovoproteincrystalstructuredeterminationfromX-rayfree-electronlaserdata[8]X-射线晶体学研究人员一般会花很多时间优化结晶条件，来获得产生高质量数据集所需的大的、非常有序的晶体。最近的研究表明，来自X-射线自由电子激光器的极短的、强烈的X-射线脉冲，可被用来在晶体的辐射损伤发生之前获得关于纳米到微米大小的蛋白晶体的数据。研究人员希望，这种方法（被称为“序列飞秒晶体学”方法）将能产生不会形成宏观的、非常有序的晶体的蛋白和蛋白复合物的结构。“序列飞秒晶体学”方法的一大局限性是，在没有事先知道一种蛋白的相关已知结构的情况下，此前一直没有可能确定其结构。在这篇论文中，作者介绍了“序列飞秒晶体学”方法何以能够与X-射线自由电子激光相结合，被用来通过实验解决“相位问题”，在没有事先知道一种蛋白是什么样的情况下生成它的高分辨率结构。2.3文献三Science：获取更好蛋白质结构的新方法SerialFemtosecondCrystallographyofGProtein–CoupledReceptors[9]称为G蛋白偶联受体（GPCRs）的蛋白质是重要的药物靶标，但研究人员苦于弄清楚其结构。加利福尼亚斯克里普斯研究所VadimCherezov和同事利用X射线自由电子激光器改良了标准的X射线晶体学技术，捕获神经递质羟色胺的G蛋白偶联受体的系列结构图像。在室温下保存的微小5-羟色胺受体晶体上，研究团队使用该技术得到的结构不同于那些使用常规方法探测获得的冷却较大晶体结构。结果表明，室温下自由电子激光方法可以更好地捕捉自然环境中的蛋白质构象。X射线自由电子激光（FEL）装置是具有可工作于整个X射线波段区的高亮度、短脉冲、可调谐的新型相干X射线光源。3.X射线晶体学技术展望[10.11]施一公曾在cell上撰文写了一篇关于X射线晶体学在结构生物学中应用的综述。他指出在过去的几年中，X射线技术受到冷冻电镜技术的冲击，且冷冻电镜有它自身的优势。但是X射线自由电子激光的终极目标是使得单个原子可视化。在接下来的几年中，X射线晶体学还会在结构测定领域占据主导地位。因为这种方法分辨率高、在世界范围内使用比较方便还有许许多多经验丰富的使用者。附上部分原文：Withinthepast2years,cryo-EMhasemergedasacompetitiveandperhapsevenmorefavoredtoolforelucidationofmacromolecularassemblieswithmolecularweightofmorethan300kDa.Intheforeseeablefuture,advancesinsamplepreparationandimageacquisitionwilllikelyexpandtheadvantagesofcryo-EMoverX-raycrystallographyintocomplexeswithsmallermolecularweights.Ontheotherhand,technologicaldevelopmentofXFELmaystronglyaffectthecomparisonofEMversusX-ray.Afterall,theultimategoalofXFEListomakere