基因转录调控

DNA转录及其调控DNATranscriptionanditsregulation基因转录（transcription）•基因表达的重要步骤就是转录（信息拷贝）•RNA聚合酶，DNA为模板•具体生化过程清楚但调控复杂•原核生物的调控相对清楚，具有借鉴意义–乳糖操纵子–蛋白质与DNA互作–蛋白质活性的变构修饰•远距离DNA调控位点通过蛋白质的折叠原核生物转录和翻译相偶联核糖体结合转录RNA数分钟完成真核生物核内mRNA蛋白质在内质网合成数小时或数月更多调控步骤真核生物的mRNA转录和蛋白质合成调控步骤8个调控步骤mRNA“帽子”结构稳定mRNA利于核糖体识别RNA聚合酶（RNAP）转录机制•RNAP结合基因的启动子（promoter）•启动子是顺式作用（cis-acting）元件（序列）•结合在顺式元件上的调控蛋白称为反式作用因子•通过基序（motif）结合（如TATAAT）•反式作用因子是转录、翻译而来•启动子共有序列（-10区、-35区）~17bp细菌RNAP结构特点•RNAP（全酶）=核心酶+σ因子•核心酶负责催化合成：αI,αII,β,β’,ω•核心酶结合DNA任一部分可启动转录•σ因子阻止这一过程，保证特异位点转录蟹爪状蟹螯结合-10、-35区大肠杆菌的不同σ因子Mycoplasmagenetalia1个，Streptococcuscoelicolour，63个；Bacillussubtilis18个芽孢相关硝酸纤维素结合实验证明σ因子促进RNAP与启动子结合的强度3H标记的dsDNA非标记的dsDNARNAP全酶RNAP核心酶转录的起始封闭的启动子复合物可逆结合双链DNA开放的启动子复合物部分解链DNA不可逆启动子的释放开始RNA合成并离开σ因子变构利于RNA转录的延伸（9-12nt）核心酶发生显著的变构RNAP-DNA接触的变化（σ因子）形成“转录泡”大约30bp（RNA保护实验）含有核苷酸、产物两个结合位点合成并移动一个碱基保持9-12bp长的RNA-DNA杂合链核心酶高速移动模型转录的终止终止子终止信号终止序列不依赖ρ茎环结构之后的7-8个“U”依赖ρ结合“rut”位点六聚体、可移动防“readthrough”解杂合链、RNAP释放无共同序列之后无“U”翻译终止点高保真转录（proofreading）•RNAP沿RNA可以随时向后滑动（~5bp）•滑动后可以恢复原位•也可以切掉新合成的RNA，去掉配错的核苷酸•继续链的延伸•环状基因组•复制方向5’-3’•复制半圆1、2•顺时针和逆时针转录•复制与转录方向相同细菌染色体的转录方向转录的调控Jacob-Monod操纵子（operon）模型•调控基因产物“R”•R（或结合其他因子后）结合操纵基因（operator）•调控结构基因的表达1959年操纵子模型的意义和作用•打破了“onegene，oneenzyme”学说•模型的来由•β-半乳糖苷酶受乳糖诱导•λ噬菌体从溶源性到裂解阶段•导致了mRNA的发现体外结合试验：证明阻遏子与Lac操纵基因的结合后期验证：DNaseI足迹EMSA操纵子操纵子是细菌基因表达和调控单元包括结构基因和调控序列多顺反子转录（Polycistron）乳糖操纵子适应环境（碳源）改变代谢模式（C源）基因调控的经典正调控：cAMP+CRP（CAP）负调控:阻遏物围绕起始复合体调控乳糖操纵子的基础转录•正和负调控•葡萄糖导致cAMP下降•CAP（CRP）激活需要cAMP•缺少CAP的作用，RNAP维持基础的转录水平–RNAP随机与启动子结合并起始转录的频率•基础转录比高效转录低29-40倍•ρ因子参与调控–氨基酸水平低下时候起终止作用–避免细胞在缺少氨基酸时还翻译蛋白质（消耗）半乳糖相关糖类的结构乳糖操纵子广泛用于-重组子筛选-原核蛋白表达lacZ、IPTG异乳糖异丙基硫代半乳糖苷转录调控因子的作用模式•带有不同结构域：蛋白-DNA、蛋白-蛋白•一种调控因子结合DNA可能需要另外一个协助•远距离DNA调控位点可能通过蛋白相互作用拉近•蛋白之间的协助不需要变构–CAP：DNA结合、RNAP（C端α-螺旋）结合–即使浓度低时也可以互相协助与DNA（启动子）结合•变构与DNA结合–例如CAP、Lac阻遏物与DNA结合–CAP：结合cAMP发生变构，二聚体结合DNA使之弯曲–HTHstructuremotif：α-螺旋插入DNA大沟•DNAlooping：阿拉伯糖操纵子CAP与DNA结合90度二聚体Lac阻遏物与DNA结合结合IPTG变构DNA结合域盐桥阿拉伯糖操纵子AraC调控蛋白既是阻遏子又是激活子AraC处于阻遏状态AraC处于激活状态改变DNA螺旋证明O2负调控增加半个螺旋RNA调控基因的表达色氨酸操纵子弱化子10倍阻遏子60倍RNA调控核酸转换（riboswitches）结合代谢产物调控基因表达真核基因转录•真核基因约2万-5万•一些在所有细胞中转录（持家基因）•一些只在特定的细胞和发育时期表达•1980s前期主要体外研究DNA-蛋白质互作•亲和层析分离DNA结合蛋白•EMSA分析反式作用因子•DNaseI足迹分析鉴定顺时作用元件•1980s后期鉴定许多蛋白并证明蛋白互作实现调控•1990s后发现染色质结构、核结构、细胞区隔化的调控•多水平、多方位的调控机制真核RNA聚合酶基本转录“机器”转录激活或抑制因子协同转录因子或协同抑制子转录调控区•某个基因的特异转录是特异调控序列及其调控因子的组合•人类基因编码序列小于基因组的2%•调控区一般位于转录起始位置前•单细胞真核如酵母调控区很短•多细胞真核生物调控区超过10Kb，但转录长度一般2-3Kb核心启动子元件•核心启动子是指紧邻转录起始的调控区•相对远离的调控区可以称为启动子前调控元件•核心启动子位置移动导致活性丧失•TFIID是通用的识别核心启动子元件的转录因子•TATABox、Inr、BRE、MTE、DPE（元件或基序）元件TATABoxTATAA基序证明实验•腺病毒启动子含有TATABox•21bp、43两个片段克隆到pBR322•酶切线性化•体外转录•2-3样井:2个21bp同方向，分别用EcoRI、BamHI酶切•4-5：21和43相对方向，分别用EcoRI、BamHI、SalI酶真核生物启动子元件TFIID=TBP+TAF1（TBP-associatedfactor1）、TAF2远距离调控元件•酵母的UAS，距离较近且位置基本固定•大多数增强子位置可以处于上、下游或内含子内•典型增强子500bp，含有一系列调控因子的结合位点•调控基因组织、发育时期的特异表达增强子不同位置LCR（locuscontrollingregion）•组织染色质使之处于转录活跃状态•具有方向性•DNaseI超敏区域（5）•约200Kb•与RNAPII等结合•形成环状•拉近顺式位置序列•球蛋白的转录–发育时期特异性MARs（MatrixAttachmentRegions）•核骨架结合区域处于转录活跃状态•染色质处于“环状”结构•每隔5-200Kb就有MAR•AT-rich区域•DNA二级结构改变•形成一个操作平台•结合转录因子•组织特异性表达MAR作用模式•MAR分为结构MAR和功能MAR•结构MAR起“锚定”作用•功能MAR动态转换将基因带入核骨架区域阻断子（insulator）•位于常染色质（富含基因）异染色质（非编码区）之间•300p-2000bp长度的DNA序列•功能一：分开异染色质和染色质，界桩的作用•功能二：防止增强子、抑制因子作用于临近基因•至少被3个DNA结合蛋白所识别–CTCF：CCCTC结合因子，具增强子的阻断活性–USF、USF2:招募染色质修饰酶基本转录“机器”（Basaltranscriptionmechinary）•启动子识别（TF）•RNA合成基本“组件”•RNAPII和5个转录因子•TFIID：时空特异表达•TFIIB：TBP结合、定向•TFIIE：结合H•TFIIF：促进RNAP结合E、H•TFIIH：具有解旋活性•20个亚基组成的介导子•介导激活因子与增强子结合RNAPII结构12个亚基（Rbp1-12）核心酶10个(除去4、7)催化活性亚基4/7形成异源二聚体转录及转录后起作用参与转录偶联的DNA修复结构特征狭缝：合成RNA位点墙：使RNA弯90度夹子：动态变化CTD：10个7aa重复磷酸化状态复合物RNAPII磷酸化TFIIH在ATP作用下对RNAPII磷酸化解旋作用TFIIHLane1：41bp标记的单链Land2：没有蛋白（负对照）Lane3：20ngTFIIH，没有ATPLane4:10ngTFIIH，有ATPLane5:20ngTFIIH，有ATP转录因子是模块化的蛋白质•反式激活作用域•DNA结合域•二聚体域•辅因子结合域•核定位序列•核输出序列DNA结合域•DNA结合域决定了序列专一性•结合依赖于三维结构的构型和氢键•依赖于α-螺旋结构与DNA双螺旋“沟”的互作•蛋白质和核酸的N-H、O-H、O之间的氢键•疏水基团的接触•比对结合域，具有类似基序组成的不同组•基序是特定三维折叠行使特定功能的一簇氨基酸•DNA结合域常见有四类•Helix-Turn-Helix（HTH）•ZincFinger（Zif）•BasicLeucineZip（bZIP）•BasicHelix-Loop-Helix（BHLH）HTH（Helix-Turn-Helix）转录因子•简单氨基酸折叠组成的3个α-螺旋结构•第三个（识别螺旋）插入到双螺旋的“大沟”•第二个与第三个之间有β-turn•Homeodomain（HD）转录因子及其他变异类型锌指（Zincfinger）转录因子•半胱氨酸或与组氨酸共价结合锌离子•三维结构显示二聚体和DNA识别位点•C2H2、C2C2型bZIP、BHLH转录因子•CAAT增强子结合蛋白•本身没有DNA结合域•两个带bZIP形成二聚体结合到DNA上•coiled-coil结构•碱性Arg、His•环分开两个α-螺旋•二聚体后结合DNA•结合位点是碱性氨基酸（带+电）共激活（抑制）因子•不直接与DNA结合•与蛋白互作增强或抑制转录活性•分为二大类•染色质修饰（modification）复合物：组蛋白翻译后修饰有利于转录因子•染色质重建（remodeling）复合物：如依赖ATP的DNA解旋RNAPII转录过程•启动子的释放•RNA合成•保真：可调节（tunable）活性位点•延伸因子保障转录的进行