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环状RNA研究现状环状RNA（circRNA）是一类特殊的非编码RNA分子，也是RNA领域最新的研究热点。与传统的线性RNA（linearRNA，含5’和3’末端）不同，circRNA分子呈封闭环状结构，不受RNA外切酶影响，表达更稳定，不易降解。在功能上，近年的研究表明，circRNA分子富含microRNA（miRNA）结合位点，在细胞中起到miRNA海绵（miRNAsponge）的作用，进而解除miRNA对其靶基因的抑制作用，升高靶基因的表达水平，进而在转录水平上对靶基因进行调控；这一作用机制被称为竞争性内源RNA（ceRNA）机制。通过与疾病关联的miRNA相互作用，circRNA在疾病中发挥着重要的调控作用。一、环状RNA相关研究环状RNA（circularRNA,circRNA）是一类新近发现的内源性非编码RNA（non-codingRNA,ncRNA），是最近RNA领域的最新的研究热点。Sanger等在20世纪70年代发现某些高等植物中存在可致病的单链环状类病毒，这是人类首次发现cirRNA。随后人们陆续在酵母线粒体、丁型肝炎病毒中发现cirRNA，也发现在小鼠的睾丸内含有性别决定基因（sex-determiningregionY,Sry）转录而来的cirRNA，还证实了cirRNA也存在于人体细胞。随着高通量测序及生物信息学的快速发展，越来越多的cirRNA在生物体中被发现，它们广泛的，多样化的，保守的，稳定的存在于真核生物中，丰富了RNA家族的内容。不同物种中鉴定的cirRNA数目是不一样的，总结目前已经发表的研究中cirRNA的鉴定情况如下：刘骏武研究植物水稻的cirRNA，利用总RNA-seq数据，分别利用find_circ、STAR、CIRI三种软件同时进行预测，只选取具有canonical位点的环状RNA，分别找出20、155、69个，取三个软件结果的并集，总共有213个环状RNA。植物拟南芥选取经过Poly（A)富集的RNA-seq数据，利用find_circ、STAR、CIRI三种流程预测环状RNA，分别预测出canonical类型的为17、2、14个，取三种软件的并集共24个环状RNA。陈肖等研究报道家蚕体内可能存在300多个cirRNA基因片段。有研究报道，在线虫体内，利用find_circ流程共鉴定出1531个cirRNA。Memczak报道HEK293细胞中存在1950种cirRNA，小鼠脑组织中存在1903种cirRNA。Jeck等在人类成纤维细胞中发现了大于25000种RNA含有非共线索尾插接外显子，揭示了cirRNA产生的一种方式即外显子跳读，以及Alu重复序列在cirRNA形成中的作用。二、环状RNA的形成机制根据环状RNA剪接来源的不同，将其分为外显子环化形成的环状RNA（exoniccirRNAs）和内含子环化形成的环状RNA（cirRNAs）。1、外显子环状RNA的形成机制外显子环状RNA通过反向剪接的方式形成，目前形成机制存在两种假设：第1种机制认为在外显子环状RNA形成过程中，前体RNA转录时发生了部分折叠，外显子就会随着RNA的折叠出现跳跃现象，这样在被跨越的部位形成外显子包含内含子的环状RNA中间体套索结构，接着套索内部进行剪接，去除内含子序列后形成环状RNA。第2种机制认为环状RNA的形成是由于在形成环状RNA的前体序列两侧内含子上存在反向互补序列，正是由于两侧内含子的互补配对介导了环状RNA的形成。由于外显子环状RNA在细胞中广泛存在，且其形成机制尚处于推测阶段，因此需要科研工作者对其形成过程中的相关调控及加工方式作进一步的研究。外显子环状RNA可能的形成机制示意图在外显子环状RNA的两种形成机制中，一些证据表明，自身的反向剪接序列可能比外显子跳跃发生的更频繁。有些线性mRNA缺失的外显子，被包含在某个环状RNA中，说明外显子跳跃可能也是一个合理的机制。Steven等在研究中通过RNA-Seq和qPCR发现，外显子跳跃可能诱导环状RNA的产生。对于两侧内含子互补配对形成环状RNA的机制，Jeck等研究发现在成环的序列中包含有串联重复的ALU序列，这种现象与两侧内含子互补配对促进成环的机制是一致的。2、内含子环状RNA的形成在某些组织中，内含子可以独立环化形成环状内含子RNA（circularintronicRNA,ciRNA），称为内含子环化。内含子环化主要存在于细胞核中，它们的形成依赖于含有邻近5’剪接位点处的7个核苷酸GU富集元件以及3’剪接位点处的的11个核苷酸C富集元件，具有少量的miRNA靶点。3、外显子-内含子环状RNA的形成有研究学者发现了环化外显子中间保留有内含子，称其为外显子-内含子环状RNA（exon-in-troncircRNAorEIciRNA），EIciRNA的发生机制尚不明确。三、环状RNA的特征根据已有文献报道，circRNA具有以下显著特点：1.与线性RNA不同，circRNA形成没有3’末端和5’末端的共价环状结构，因此不易于被核酸外切酶降解，比线性RNA更稳定。2.种类繁多，而且有些circRNA高于其相应的线性RNA10倍之多。3.circRNA主要由外显子构成，少部分由内含子环化形成。4.一些circRNA富含microRNA（miRNA）反应元件（microRNAresponseelement,MRE），可扮演竞争性内源RNA（competingendogenousRNA）角色，可与miRNA结合，在细胞内发挥miRNA海绵的作用，抑制miRNA发挥功能从而调节基因表达水平。5.环状RNA具有时空特异性。例如，ciRS-7在脑组织中表达较高，而在非神经组织中表达量则较低。DOCK1基因表达的环状RNA在乳腺癌细胞系MCF-7中呈高表达，而在肺癌细胞系A549中则几乎不表达。在不同发育时期的线虫胚胎细胞中，环状RNA种类及相对表达量均存在显著差异。时空特异性是环状RNA具有特定功能的证据，也是将其运用于开发临床疾病诊断标记物的基础。6.大多数circRNA为内源性ncRNA，仅有部分外源性circRNA是可以翻译表达的，例如丁型肝炎病毒（hepatitisDvirus,HDV）与含有内部核糖体进入位点序列（internalribosomeentrysite,IRES）的工程circRNA。7.环状RNA不同物质间进化上具有保守性。这些特点显示circRNA在转录水平与转录后水平可能发挥着重要作用，可作为疾病诊断的理想标志物。四、环状RNA的功能1、环状RNA与miRNA的相互作用ceRNA含有miRNA应答元件（microRNAresponseelement,MRE），可通过MRE竞争性结合miRNA。因此，ceRNA可以影响miRNA调节基因表达的功能。近来，越来越多的研究表明circRNA可发挥miRNA海绵或ceRNA的作用。例如，有研究显示，外显子来源的circRNAciRS-7/CDR1as（miR-7或CDR1的环状RNA海绵）与性别决定域Y（sexdeterminationregionY,SRY）可以结合miRNA，而且可逃脱降解，使得他们成为很好的ceRNA替代者。Hansen等发现脑降解相关蛋白1（cerebellardegeneration-relatedprotein1,CDR1）可翻译产生一个名为反义脑降解相关蛋白1的自然环化转录子（cerebellardegeneration-relatedprotein1transcript,CDR1as）。CDR1as可与miRNA结合，并且可由miR-671（microRNA-671）降解。研究证实miR-671可与CDR1as完全互补并引起其降解。随后研究证实CDR1as包含有70多个miR-7结合位点，并与大量阿格蛋白（argonaute,AGO）结合。这些结合位点间的互补性可使CDR1as免于降解以及与miR-7结合，而且CDR1as沉默或者miR671过表达都可引起miR-7靶基因表达降低。此外，CDR1as在神经组织中高表达，Memczak等研究斑马鱼发现，使斑马鱼胚胎高表达CDR1as,沉默CDR1，结果发现斑马鱼中脑体积减小，同时模拟miR-7功能缺失，进而引起了中脑形态缺陷，充分证明CDR1as对miR-7的海绵作用。2、cirRNA是pre-mRNA的调节剂Ashwal-Fluss等的研究发现，cirRNA上与侧翼内含子一样也具有MBL结合位点，MBL通过与其RNA产生的cirRNA特异性结合，可以反向调节cirRNA本身的合成。他们还发现通过分别提高果蝇和人细胞内有效的线性剪接，发现cirRNA生成的含量减少，说明外显子环化可以与经典的pre-mRNA剪接相竞争，使环化与线性剪接达到一个平衡的状态，这一过程是在果蝇与人中是有组织特异性的、保守的。这些都说明了cirRNA可以调节pre-mRNA的剪接，从而影响蛋白质的产生。3、cirRNA可调控亲本基因的表达最近的研究显示，cirRNA可以调节亲本基因的表达。例如，Zhang等发现cirRNA的形成依赖于关键的侧翼RNA元件，这些RNA元件对于内含子套索环化逃逸脱支酶分离至关重要。这些cirRNA几乎没有miRNA靶点富集，表明他们的功能具有独特性。有研究表明，一些circRNA细胞核内含量丰富，通过与聚合酶Ⅱ相互作用以顺势反应方式调控宿主转录活性。接着，科学家们又陆续在人类细胞中发现了另外一种可与聚合酶Ⅱ相互作用的circRNA，这种环状RNA叫做EIciRNAs。EIciRNAs（例如circEIF3J,circPIAP2）主要定位于核内，可与小核糖核蛋白（smallnuclearribonucleoproteins,snRNPs）相互作用以顺势反应方式调控亲代基因的转录。与之类似，Li等发现cir-ITCH及ITCH3'端未翻译器共有miRNA结合位点；进一步研究发现，cir-ITCH与miR-7、miR-17和miR-214相互作用可上调ITCH表达水平。总之，可以推测外显子来源的circRNA在细胞质内发挥调节作用，而内含子来源的circRNA（如ciRNA、EIciRNA）则在细胞核内发挥转录调节作用。4、环状RNA与蛋白质的相互作用环状RNA可直接与蛋白质结合，也可通过RNA介导间接与蛋白质发生关联，影响蛋白质功能。例如，RNA剪切因子MBL可结合其亲本基因第2外显子，促进其环化形成circMbl；同时，circMbl能与MBL结合，降低MBL有效浓度，减少circMbl生成。内含子-外显子环状RNAcircEIF3J与U1RNA结合。促进U1小核核糖核蛋白（U1snRNP）复合体与RNA聚合酶II结合，增强亲本基因转录。Circ-Foxo3与激酶抑制蛋白（p21）及细胞分裂蛋白激酶（CDK2）形成复合体，抑制CDK2对细胞分裂的促进作用，阻碍细胞周期进展。5、环状RNA的翻译功能一般情况下，很少有circRNA可翻译成蛋白质。水稻黄斑驳病毒scRYMV以及人工合成的具有内部核糖体进入位点（internalribosomeentrysite,IRES）的环形RNA分子在细胞内能够翻译成蛋白质。因此，环形结构并非影响RNA编码的决定性因素。但是，目前在真核细胞内尚无内源性环状RNA可直接翻译出蛋白质的证据。Kos等在研究中发现B型肝炎病毒中的环状RNA卫星病毒肝炎δ产生与致病性相关的单个病毒蛋白。此外，科学家也报道了circRNA可能的其他功能。例如，circRNA可作为RBP海绵，即MBL与cirMbl的直接相互作用，或作为RBP工厂的装配或变构调节。另外，circRNA亦可直接通过局部碱基配对靶向mRNA。一些circRNA甚至可以作为翻译模板，研究发现，合成circRNA可以高效的翻译蛋白质。这些发现表明仍需要深入的研究来进一步阐释circRNA的新功能。五、环状RNA的预测方法根据已发表的文献，将方法分为三类：①从头预测（abinitio）的方法：fin