rna检测技术在生殖道病原体诊断中的应用检验科2015ppt课件

上海仁度生物科技有限公司ShanghaiRenDuBiotechnologyCo.,Ltd.RNA检测在生殖道病原体实验室诊断中的应用常见生殖道病原体及危害生殖支原体(MG)沙眼衣原体(CT)解脲脲原体(UU)淋病奈瑟菌（NG）不孕不育泌尿生殖道炎症眼科炎症类风湿关节炎不良妊娠/母婴感染沙眼衣原体(CT)80%的女性和50%男性感染人群无临床症状感染人群中无临床症状淋病奈瑟菌(NG)50%的女性和10%的男性无临床症状解脲脲原体(UU)75%的成人无临床症状，在孕妇中无症状比例达到80%生殖支原体（MG）50%以上感染人群无明显临床症状ClinicalEffectivenessGuidelinefortheManagementofChlamydiatrachomatisGenitalTractInfection.2001叶顺章.性传播疾病的实验室诊断.第二版.102沉默的杀手European(IUSTI/WHO)GuidelineontheDiagnosisandTreatmentofGonorrhoeainAdults.2009欧美国家指南中建议筛查CT/NGCT/NG所有妊娠女性在第一次产检时都要进行CT/NG检查，并需在孕晚期进行复查。CDCGrandRounds:TheGrowingThreatofMultidrug-ResistantGonorrhea。USACDC2013GuidelinesfortheLaboratoryDiagnosisofMycoplasmagenitaliumInfectionsinEastEuropeanCountries,2010ScreeningforChlamydiaandGonorrhea:U.S.PreventiveServicesTaskForceRecommendationStatement.2014美国2014年预防服务工作组(USPSTF)美国疾控(USCDC)2010版《性病诊疗指南》CT/NG建议所有育龄人群中进行CT/NG检查。英国2013版国家临床最优化研究所(NICE)指南建议所有育龄人群中进行CT检查。CTPreventionofinfectionafterinducedabortion.ReleasedateOctober2010.SFPGuideline20102美国计划生育学会（SFP）《人工流产后预防感染指南》•人工流产手术患者应在术前接受预防性抗生素治疗，从而降低其术后生殖道感染的风险。•对拟行人工流产手术患者，推荐术前进行沙眼衣原体和淋病奈瑟菌的筛查，对于检测阳性患者依照规范治疗后再施行手术。欧美国家指南中建议筛查CT/NGCT/NG孕前和孕期保健指南2011.中华医学会妇产科分会产科学组孕前和孕期保健指南-孕前3个月：CT/NG为备查项目-怀孕6-13周：高危孕妇、有症状者CT/NG为备查项目国家免费孕前优生健康检查项目试点技术服务规范-阴道分泌物进行CT/NG检测黏液脓性宫颈炎的诊断和治疗-对疑似患者，在确定临床体征后，应进一步做衣原体及淋病奈瑟菌的检测CT/NGCT/NGCT/NG黏液脓性宫颈炎的诊断和治疗.2012.中华医学会妇产科分会感染协作组我国指南关于CT/NG的检查建议生殖道病原体实验室检测方法细菌法免疫法分子生物学法培养法镜检法抗原抗体检测DNA检测RNA检测方法学检测方法检测样本检测复杂程度特点检测项目细菌法培养法细菌培养分泌物较复杂，检测过程长准确率低，易漏检及误检用于NG/UU/CT/MG检测形态学法涂片镜检分泌物全手工操作，较复杂准确率较高，但有漏检用于NG检测免疫法免疫法胶体金/酶联免疫法分泌物耗时短，操作简单准确率低，假阴性问题突出用于CT检测分子生物学法DNA检测PCR分泌物操作较复杂，需有一定经验才能做好检测准确率相对较高，但存在污染和死亡病原体导致的假阳性问题用于CT/NG/UU检测RNA检测TMA/SAT尿液和分泌物耗时耗时短，仪器自动化操作，较简单检测活体RNA，灵敏度和特异性均很高欧美国家用于CT/NG/MG检测常用CT/NG/UU/MG检测方法比较国外诊疗指南推荐使用分子检测法诊断生殖道病原体CT/NG美国疾控2014版《CT/NG实验室诊断指南》RecommendationsfortheLaboratory-BasedDetectionofChlamydiatrachomatisandNeisseriagonorrhoeae.USACDC.March2014.Unemoetal.Laboratorydiagnosisofsexuallytransmittedinfections,includinghumanimmunodeficiencyvirus,WHO,2013WHO2013版《性传播疾病实验室诊断方法》WHO性传播疾病实验室诊断指南利用16SrRNA为靶标的RNA检测技术（TMA），在灵敏度上比PCR要高，它是目前一种灵敏度、特异度均非常高的MG检测技术。Unemoetal.Laboratorydiagnosisofsexuallytransmitted。a.infections,includinghumanimmunodeficiencyvirus,WHO,2013WHO明确指出核酸检测法（NAAT）是诊断MG的唯一可行方法;通过RNA检测技术检测生殖支原体比PCR方法要更准确。核酸检测法（NAAT）是诊断MG的唯一可行方法WHO推荐用RNA技术检测MGRNA用于临床检验的优势灵敏度高，不易漏检：RNA拷贝数≥DNA拷贝数（e.g，16srRNA104copy/cell）与临床相关性好，可以区分“死菌”“活菌”：病原体死亡，RNA很快降解，可进行疗效评估和辅助判愈，减少无效治疗，比如抗生素滥用。无创取样：尿液检测，显著降低病人的采样痛苦和检测依从性。不易误检：靶标和扩增产物都是RNA，不易污染，不易出现假阳性。RNA检测技术NASBA（Biomerieux）(NAsequencebasedamplification)TMA（Gen-probe）(TranscriptionMediatedAmplification)SAT（上海仁度)（SimultaneousAmplificationandTesting)SAT技术SAT与PCR技术原理比较RTRNAcDNART~1000copiesT7SATDNATaqTaqPCR30分钟内扩增1010倍中国诊疗指南推荐用SAT诊断生殖道病原体梅毒、淋病、生殖器疱疹、生殖道沙眼衣原体感染诊疗指南。中国疾控中心、中华医学会皮肤性病学分会性病学组。2014。中国2014版《梅毒、淋病、生殖器疱疹、生殖道沙眼衣原体感染诊疗指南》CT/NG/UU/MG-SAT是国内唯一获得CFDA认证的RNA检测试剂SAT扩增曲线图（ABI7500）阴性结果阳性结果以CT-SAT为例SAT技术可实现尿液检测样本类型：宫颈拭子、尿液金华中心医院浙大医学院附属妇产科医院临床结果显示拭子和尿液标本检测阳性率基本一致。郑雅萍袁青陈伟,实时核酸恒温扩增技术在奈瑟菌感染检测中的应用,《浙江实用医学》,2015年01期沙眼衣原体淋病奈瑟菌编号作者发表时间研究中心病例数项目灵敏度特异性诊断标准1王千秋等2010中科院北京协和医学院皮肤病研究所205NG100%94.5%PCR2顾伟鸣等2010上海市皮肤病性病医院229CT97.1%100%培养+PCR3高志华等2012东莞市南方医科大学广济医院218NG100%97.08%培养+PCR4陈敏等2014湖南省妇幼保健院,解放军163医院200CT88.12%100%培养+PCR5郑雅萍等2015金华市中心医院153NG95.9%88.8%分离培养SAT技术具有高灵敏度，高特异性男科多种样本类型检测（课题）仁度CT/NG/UU/MGRNA检测试剂用于精液检测采用SAT技术对438例男性精液标本进行CT/NG/UU/MG检测结论：1、SAT技术可对精浆标本进行CT/NG/UU/MG检测。2、与医院传统检测方法相比，传统检测方法阳性标本，SAT检测均为阳性；同时SAT还比传统方法多检出阳性标本。2.74%0.23%48.86%2.51%0.00%10.00%20.00%30.00%40.00%50.00%CTNGUUMG阳性率阳性率仁度UU/MGRNA检测试剂用于尿液和前列腺液检测（同一患者同时采集尿液和前列腺液）前列腺液标本合计阳性阴性尿液标本阳性35136阴性06363合计356499表199例患者两种样本类型UU检测结果前列腺液标本合计阳性阴性尿液标本阳性303阴性09696合计39699表299例患者两种样本类型MG检测结果结论：前列腺液检测阳性样本，尿液检测均为阳性！SAT可应用于前列腺液和尿液的检测！操作简单-----小批量样本检测样本磁珠法提取核酸恒温扩增检测结果报告操作简单----大批量样本检测全自动高通量样本适用范围广全自动样本制备工作站的开发阴性结果阳性结果全自动核酸提取仪适用范围广-----多种检测机型ABI系列荧光定量PCR仪器罗氏实时荧光PCR仪器STRATAGENE荧光定量PCR仪器西安天隆实时荧光PCR仪器CT/NG/UU/MG-SAT产品特点SAT产品特点SAT的优势带给检验科的益处检测靶标：RNA灵敏度高活菌检测可尿液检测结果准确度高，可靠尿液检测，减少医务人员工作量，减轻病人痛苦扩增产物：RNA产物易降解，减少实验室污染风险维护实验室质控水平实验室质控、污染非常少核酸提取：超声波处理15min操作简单，快速操作简单、易掌握扩增方式：42℃恒温降低实验室设备要求缩短检测时间减少工作量提高工作效率检测方法：实时荧光检测实时反映扩增反应的动态过程结果是否容易判读CT/NG/UU/MG-SAT项目开展相关参数CT/NG/UU/MG-SAT项目开展相关参数样本样本类型宫颈拭子、尿道拭子、阴道拭子（MG项目）、尿液样本保存尿液样本2℃～30℃条件下24小时内加入样本保存液加入样本保存液的标本，-20℃保存3个月，-70℃可长期保存。注意：不立即进行检测的样本，最好放入-20℃冻存，防止样本RNA降解。试剂主要试剂CT/NG/UU/MG-SAT试剂盒试剂保存A盒（提取盒）：4℃冰箱冷藏B盒（扩增检测盒）：-20℃冰箱冻存主要设备提取磁珠分离器、电动吸引器扩增检测荧光定量PCR仪（ABI系列PCR仪、Roche480等）、连续加样枪操作操作步骤样本处理→核酸提取→扩增检测操作时间样本处理时间90min，上机和检测时间60min，共计2.5h（手工48个）结果影响因素样本来源、样本性状、操作技术（尤其重要）一般分子实验室需增加的配套设备小批量样本操作磁珠分离器电动吸引器连续加样枪大批量样本操作全自动核酸提取仪0.2mL金属浴（96孔）SAT生殖道检测产品已在多家医院使用新疆佳音医院毓璜顶医院北京协和北京大学第三医院舟山医院浙江普陀医院浙江省中医院杭州市第三人民医院慈溪市人民医院宁波市第二人民医院广州市妇女儿童医院同济大学附属杨浦医院上海长征医院南通妇幼医院南通六院无锡二院嘉兴市第二医院南医大二附院中大第二附属医院小结取样方便、自动化操作、准确性高是病原体分子诊断的发展趋势RNA诊断技术解决了DNA诊断技术在CT/NG/UU/MG检测中的一些局限，除了拭子还可进行尿液检测，是目前所有商品化试剂中灵敏度、准确度最高的产品之一。仁度的MG-SAT是国内唯一可检测MG的核酸检测产品。仁人爱物，为和度，和而不同THANKYOU!