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蛋白质免疫印迹技术及常见问题分析WesternBlotWesternBlot简介WesternBlot一般流程WesternBlot常见问题分析WesternBlotWesternBlot简介：印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法。WesternBlotWesternBlot基本原理：首先利用SDS-PAGE对蛋白质样品进行分离，然后转移到固相载体（例如NC膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。转移后的NC膜就称为一个印迹（blot）,用于对蛋白质的进一步检测。印迹首先用蛋白溶液（如5%的BSA或脱脂奶粉溶液）处理以封闭NC膜上剩余的疏水结合位点，而后用所要研究的蛋白质的抗体（一抗）处理，印迹中只有待研究的蛋白质与一抗特异结合形成抗原抗体复合物，而其它的蛋白质不能与一抗结合，这样清洗除去未结合的一抗后，印迹中只有待研究的蛋白质的位置上结合着一抗。WesternBlotWesternBlotting方法直接法：优点：1.快速（一种抗体）2.没有二抗交叉反应引起的非特异性条带缺点：1.免疫反应性降低2.无信号二级放大3.抗体标记费时昂贵,使用不方便WesternBlot间接法：优点：1.免疫特异性不受标记影响2.信号放大,灵敏度高（多个二抗结合位点）3.多种标记的二抗可供选择4.可选择不同的Marker缺点：1.有交叉反应引起的非特异性条带2.额外的二抗孵育以及条件优化WesternBlot处理过的印迹进一步用适当标记的二抗处理，二抗是指一抗的抗体，如一抗是从鼠中获得的，则二抗就是抗鼠IgG的抗体。处理后，带有标记的二抗与一抗结合形成抗体复合物可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白质的位置。目前有结合各种标记物的抗特定IgG的抗体可以直接购买作为二抗，最常用的一种是酶连的二抗，印迹用酶连二抗处理后，再用适当的底物溶液处理，当酶催化底物生成有颜色的产物时，就会产生可见的区带，指示所要研究的蛋白质位置。该技术广泛应用于检测蛋白水平的表达。WesternBlot直接法与用二抗的间接法相比有诸多不足，标记二抗可用于很多种不同特异性的一抗，避免了标记很多一抗的需要，同时因为一抗结合不止一个二抗分子，所以二抗可以增强信号。所以一般情况下都釆用间接法进行检测。WesternBlotWesternBlot优点：结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种优点高分辨率的电泳技术特异敏感的抗原-抗体反应1-5ng（最低可到10－100pg）中等大小的靶蛋白WesternBlotWesternBlot应用目的蛋白的表达特性分析目的蛋白与其它蛋白的互作目的蛋白的组织定位目的蛋白的表达量分析WesternBlot被广泛地应用于蛋白质研究，基础医学和临床医学的研究。WesternBlotWesternBlot流程蛋白样品的制备•SDS-PAGE•转膜•封闭•一抗杂交•二抗杂交•底物显色WesternBlot通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白水溶液提取法针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂。有机溶剂提取法对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，包括乙醇、丙酮和丁醇等。通过层析或电洗脱法制备目的蛋白蛋白样品的提取WesternBlot蛋白样品的定量目前常用比色法测定样品蛋白的含量：Bradford法（考马斯亮蓝法）、Lowry法（Folin-酚试剂法）、BCA法等。但各有优缺点，大家可以根据具体情况选取。按相应蛋白质定量试剂盒操作说明操作，测定样品浓度。蛋白质浓度测定的各种方法汇总：聚丙烯酰胺凝胶电泳丙烯酰胺和N,N’-亚甲双丙烯酰胺SDS配胶的Tris缓冲液TEMED过硫酸铵Tris-甘氨酸电泳缓冲液凝胶成分WesternBlot1.1PAGE：聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamidegel)是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂(crosslinker)N,N’-亚甲基双丙烯酰胺(N,N’-methylenebisacylamide，简称Bis)在催化剂和加速剂作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。化学惰性强，具有一定的机械强度和透明度。是良好的电泳介质。WesternBlot聚丙烯酰胺凝胶的聚合方式：•单体：丙烯酰胺（Acr）；•交联剂：甲叉双丙烯酰胺（Bis）；•催化剂：过硫酸胺或核黄素（AP）；•加速剂：四甲基乙二胺（TEMED）；•产物：三维网状结构凝胶•聚丙烯酰胺凝胶聚合机理是通过提供氧游离基(freeradicals)的催化，使体系发生氧化还原作用(catalyst-redoxsystems)来完成的。催化体系主要有化学催化（AP—TEMED）和光化学催化（核黄素——TMTED）体系。影响聚丙烯酰胺凝胶聚合的因素：试剂的纯度；温度；氧气；AP、TEMED原则：尽量少的催化剂并在最佳时间内聚合。WesternBlot1.2蛋白样品的变性2×SDS-PAGE上样缓冲液：DTT可临用前以1：4比例混合加入，亦可全部配好分装，-20℃冻存。按1:1比例与蛋白质样品混合，95～100℃加热5～15min，冰上冷却后再上样，使蛋白充分变性，保证蛋白质从空间结构变为一级结构。电泳样品已准备就绪，可立即使用也可以分装冻存，-20℃存放的样品可稳定保持数月。1MTris-HCl(pH6.8)10ml1MDTT20mlSDS4g甘油20ml溴酚蓝0.2g总体积100ml①100mMTris-HCl(pH6.8)②200mMDTT③4%SDS④0.2%溴酚兰⑤20%甘油⑥ddH2OWesternBlotSDS-PAGE是在蛋白质样品中加入SDS和含有巯基乙醇的样品处理液，SDS是一种很强的阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。强还原剂巯基乙醇（或二硫苏糖醇，DTT）可以断开二硫键破坏蛋白质的四级结构。使蛋白质分子被解聚成肽链形成单链分子。解聚后的侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。蛋白质分子结合SDS阴离子后，所带负电荷的量远远超过了它原有的净电荷，从而消除了不同种蛋白质之间所带净电荷的差异。蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚基的相对分子质量，而与其所带电荷的性质无关。【SDS-PAGE基本原理】WesternBlotSDS：阴离子去污剂变性剂氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS胶束。蛋白质-SDS胶束所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，消除了不同分子之间原有的电荷差异。与强还原剂一起使蛋白分子氢键、疏水键打开，使蛋白质分子线性化。WesternBlot蛋白质-SDS胶束的特点：（1）具有相同的形状，形状像一个长椭圆棒（2）平均1g蛋白质结合1.4gSDS（3）短轴对不同的蛋白质亚基-SDS胶束基本上是相同的（4）长轴的长度则与亚基分子量的大小成正比WesternBlot不连续的电泳缓冲体系。SDS—蛋白质复合物在凝胶电泳时，不再受蛋白质电荷与形状的影响，而只取决于蛋白质分子量的大小。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳WesternBlot1.3不连续电泳：作用缓冲液PH凝胶浓度浓缩胶使蛋白样品浓缩pH6.8Tris-Cl低，2-5%分离胶使蛋白样品分离pH8.8Tris-Cl高，根据蛋白大小电泳缓冲液：pH8.3Tris-甘氨酸系统。WesternBlot1.4凝胶浓度与蛋白分离范围凝胶浓度（％）线性分离范围（KD)1512-431016-687.536-945.057-212SDS-PAGE浓缩胶(5%Acrylamide)及分离胶配方表：凝胶配制配制相应浓度的SDS-PAGE分离胶，TEMED加入后迅速混匀制胶，沿壁迅速灌注分离胶溶液，留出积层胶所需空间（梳齿长再加1cm）。覆盖5mm水(或异丙醇）层于分离胶溶液上，约30-60min后分离胶和水层之间会出现清晰界面，表明分离胶充分聚合（可微微倾斜模具，检测凝胶是否聚合）。ddH2O轻轻洗涤凝胶顶部数次，以除去未聚合的凝胶，再用滤纸吸净残留液体，注意不要接触胶面。灌制分离胶WesternBlotSDS-PAGE凝胶配制覆盖层可保持胶面平整和防止空气进入，因为氧气扩散进入凝胶会抑制聚合反应。灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。胶浓度＜10%时可用0.1%的SDS封，浓度＞10%时用水饱和的异丁醇或异戊醇，也可以用0.1%的SDS。封胶后切记，勿动。ddH2O0.1%SDS:8%异丁醇：8%隔绝空气WesternBlot灌制积层胶插入梳子凝胶的质量直接影响以后的实验结果，要特别注意几点：凝胶要均一没有气泡；积层胶与分离胶界面要水平；AP和TEMED的量不能过多，太多会导致胶易脆裂；拔梳子时要快，尽量保证点样孔平整。WesternBlotStakinggelSeparatinggel注意事项：1.抗原样品与缓冲液混合水浴加热时不要进水！最好采用空气浴；2.电泳Buffer最好不要重复利用，因为样品比较珍贵，而电泳液相对廉价；3.Buffer一定要漫过梳子孔，否则就会发现蛋白跑不动；4.电泳时先用低电压跑过浓缩胶，再换高电压跑分离胶，不要追求速度，慢慢跑条带会分离的更好，特别是对于高分子量的目的蛋白。WesternBlot2.转膜要将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到固相载体（例如NC膜）上，通常有两种方法：毛细管印迹法和电泳印迹法。常用的电泳转移方法有湿转和半干转。两者的原理完全相同，只是用于固定胶/膜叠层和施加电场的机械装置不同。WesternBlot转移膜的选择最常用于WesternBlot的转移膜主要是硝酸纤维素（Nitrocellulose，NC）膜和聚偏二氟乙烯（PolyvinylideneFluoride,PVDF）膜，此外也有用尼龙膜、DEAE纤维素膜做蛋白印迹。尼龙膜和NC膜的特点相似,主要用于核酸杂交。各种膜的详细特点介绍：转印膜比较WesternBlot膜的选择主要根据：a.膜与目的蛋白分子的结合能力（也就是单位面积的膜能结合蛋白的载量），以及膜的孔径（也就是拦截蛋白的大小）；b.不影响后续的显色检测（也就是适和用于所选的显色方法，信噪比好）；c.如果后继实验有其他要求，比如要做蛋白测序或者质谱分析，还要根据不同目的来挑选不同的转移膜。WesternBlot湿转系统WesternBlot半干转移系统WesternBlot丽春红染色蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗硝酸纤维素滤膜，换水几次。印度墨汁染色只用于放射性标记抗体或放射性标记A蛋白探针的Western印迹过程。印度墨汁不能和化学发光物合用，若是使用呈色反应的酶检测法时，印度墨汁的黑色会使凝胶难于拍照。转膜后检测（此步可以省略）WesternBlot封闭为避免作为检测试剂的特异性第一抗体