ELISA-双抗夹心法检测抗原解析

酶联免疫吸附实验(Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay，ELISA)一种固相酶免疫测定技术，利用酶标记的抗原或者抗体，在固相载体上定量或定性测定特异性抗体、可溶性抗原及细胞表面抗原。1971年由瑞典学者Engrall和Perlmann,荷兰学者weeman和Schuurs报道；开创了运用酶标记免疫技术进行液体标本中微量物质测定的实验方法；ELISA-测抗原（Ag）或抗体（Ab）三要素抗原或抗体的固相化：已知的Ag/Ab结合到固相载体表面，并保持其免疫活性；抗原或抗体的酶标记：酶标Ag/Ab,并保持其免疫活性和酶活性；底物显色：底物被酶催化成为有色产物—定性和定量–放大免疫反应的信号基本原理高度特异性：保持抗原抗体反应的特异性高灵敏度：酶催化底物显色的高效性，pg水平微量检测定性定量检测：反应液颜色深浅或光密度值基本特点基本类型•抗体测定法间接法检测特异性抗体•抗原测定法直接竞争法检测可溶性抗原双抗体夹心法检测可溶性抗原（改良双抗体夹心法检测可溶性抗原）应用生物素-亲和素双抗体夹心ELISA法基本类型•抗体测定法间接法检测特异性抗体•抗原测定法直接竞争法检测可溶性抗原双抗体夹心法检测可溶性抗原（改良双抗体夹心法检测可溶性抗原）应用生物素-亲和素双抗体夹心ELISA法显色间接法检测特异性抗体包被已知抗原与待测抗体孵育与酶标抗体孵育加入底物包被已知抗原优点:1.只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法2.操作简单迅捷缺点：可重复性差通常用于抗体效价的检测和某些疾病的早期诊断基本类型•抗体测定法间接法检测特异性抗体•抗原测定法直接竞争法检测可溶性抗原双抗体夹心法检测可溶性抗原（改良双抗体夹心法检测可溶性抗原）应用生物素-亲和素双抗体夹心ELISA法直接竞争法检测可溶性抗原原理：待检抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合；待检抗原含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅。优点：•待检抗原只需要一个抗原决定簇，适合小分子抗原，如，激素，药物等；•操作步骤简单快捷，只需要一个保温洗涤过程缺点：•酶标记抗体用量大；•定量检测的灵敏度和重复性存在不足。基本类型•抗体测定法间接法检测特异性抗体•抗原测定法直接竞争法检测可溶性抗原双抗体夹心法检测可溶性抗原（改良双抗体夹心法检测可溶性抗原）应用生物素-亲和素双抗体夹心ELISA法改良双抗夹心法双抗体夹心法检测可溶性抗原双抗夹心法优点：•待测抗原需要≥2个抗原决定簇，所以适合大分子抗原的检测，一般在分子量5000D以上；•由于增加了一层抗体，提高了特异性检测的灵敏度，尤其是改良双抗夹心法；只要获得针对受检抗原的特异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物就可以建立此法；•重复性较好；缺点：操作复杂，费时费力基本类型•抗体测定法间接法检测特异性抗体•抗原测定法直接竞争法检测可溶性抗原双抗体夹心法检测可溶性抗原（改良双抗体夹心法检测可溶性抗原）应用生物素-亲和素双抗体夹心ELISA法应用生物素-亲和素双抗体夹心ELISA法（BA-ELISA法）间接包被放大终末反应BA-ELISA原理BA-ELISA是在常规ELISA原理的基础上，结合生物素(B，biotin)与亲和素(A，avidin)间的高度放大作用，而建立的一种检测系统。生物素是动植物体内广泛分布的一种小分子生长因子，又名辅酶R或维生素H；亲和素是卵白蛋白中提取的一种碱性糖蛋白，对生物素有非常高的亲和力；（链酶亲和素是从链霉菌中提取，对载体吸附性比前者低）亲和素与生物素都可与蛋白质(包括抗原、抗体、酶等)、荧光素等分子结合而不影响后者的生物活性，是理想的标记剂；结合了酶的亲和素分子与结合有特异性抗体的生物素分子产生反应，既起到了多级放大作用，又由于酶在遇到相应底物时的催化作用而呈色，达到检测未知抗原(或抗体)分子的目的。实验材料小鼠INF-γ检测试剂盒的组成：CaptureAb：purifiedanti-mouseIFN-γDetectionAb：biotin-conjugate-anti-mouseIFN-γAvidin-conjugate-HRPStandard：recombinantmouseIFN-γ（定量测定）Coatingbuffer5×AssaydiluentTMBsolution待测样品----经ConA活化的小鼠淋巴细胞培养上清ELISA操作要点样品的保存试剂的准备固相载体包被加样孵育(温育）洗涤显色和比色样本的制备与保存：血清样品和细胞培养上清：5天内测定，可以放置于4℃，超过一周，-80℃保存；ConA活化的小鼠淋巴细胞培养上清：分别于活化后不同时间点收集培养的细胞，2000rpm，4℃离心分离上清，冰上放置，分装试剂的准备•ELISA中用的蒸馏水或者去离子水，包括用于配置coatingbuffer，稀释Assaybuffer，洗涤的，应为新鲜的和高质量的；•从冰箱中取出的试剂应该平衡至室温后使用；•试剂最好现配先用固相载体•最常用的是聚苯乙烯：有较强的吸附蛋白质的性能；•国际上标准的是微量滴定板8×12的96孔板式；•已经包被抗原或者抗体的固相载体在低温（2-8℃）干燥的条件下一般可以保存6个月。包被•定义：将抗原或者抗体固定在固相载体的过程称为包被；•物理吸附：两者的疏水基团通过疏水键的作用•抗体或者蛋白质抗原一般采用pH9.6的碳酸盐缓冲液作为稀释液（即本次实验用的coatingbuffer）•4-8℃包被过夜(有利于蛋白活性的保持），与37℃孵育2小时被认为具有相等的包被效果•包被的最适当浓度随着载体和包被物的性质和酶结合物的浓度调定封闭•定义：继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程；•目的：抗原或抗体包被时所用的浓度比较低，吸收后固相载体表面尚有未被占据的空隙，封闭就是让大量的不相关蛋白质填充这些空隙，从而排斥在ELISA其后的步骤中干扰物质的再吸附；•常用封闭液：2%牛血清白蛋白，10%NBS+5%羊血清，5%脱脂奶粉；本实验用封闭液：1×Assaybuffer。加样•ELISA中一般有3次加样步骤，即，加样本（和/或标准品），加酶结合物，加底物；•加样时应将所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可以溅出,不可以产生气泡；•多道加液器的使用孵育(温育）•在ELISA中抗原抗体反应的完成需要有一定的温度和时间，这一保温的过程称为孵育；•常用温度：43℃，37℃，室温，4℃等•孵育时为了避免蒸发，可以用塑料封口胶或者保鲜膜封板洗涤洗涤在ELISA中虽然不是一个反应步骤，但决定了实验的成败•聚苯乙烯等塑料对蛋白的吸附是普遍的，洗涤可以清除在反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质•洗涤可以清除残留在板孔中没有能够与固相抗原或者抗体结合的物质•常加入非离子表面活性剂（含有疏水基团+亲水基团），以抑制蛋白质吸附于塑料表面，如吐温20，0.05%的浓度比较合适，浓度＞2%会洗脱包被在板上的抗原或者抗体洗涤方式：•甩干孔内的反应液•浸泡，即将洗涤液注满板孔(约300μl），静置3min，浸泡时间不可以随意缩短；•甩去液体后在吸水纸上拍干•重复操作2，3，洗涤次数按要求操作显色和比色显色是ELISA中的最后一步孵育反应，此时，酶催化无色的底物生成有色的产物；•定量实验中，加入底物后的反应温度和时间应该按规定力求准确；定性测定的显色时间一般不需要严格控制和及时判断；•终止反应，防止反应过度：TMB受光照影响不大，经HRP作用后，40min达到高峰；终止液有多种，叠氮钠或SDS等酶抑制剂可以维持蓝色12-24h不褪色；OPD受光照会自行变色，要避光，经HRP作用后，37℃孵育20-30min后颜色即不再加深；常用终止液为2MH2S04；HRP的色原底物系统与HRP反应后的颜色加终止液后的颜色读数波长特点OPD临苯二胺492nm致畸，但本底好TMB四甲基联苯胺450nm操作方便，本底较高ELISA数据的处理•根据standard的浓度和对应的OD值计算出线性方程•将所测定样品的OD值代入方程计算出相应的样品的浓度Protocal1.包被：用Coatingbuffer1:1000稀释CaptureAb，100ul/孔，湿盒4℃过夜；2.洗板：弃去孔内液体，PBST洗涤，3×3min，控干；3.封闭：加1×Assaydiluent200ul/孔，37℃避光孵育2h；4.洗板：弃去孔内液体，PBST洗涤，4×3min，控干；5.加样：100ul/孔，37℃避光孵育1h；6.洗板：弃去孔内液体，PBST洗涤，4×3min，控干；7.Biotin-DetectionAb:用1×Assaydiluent1:1000稀释detectionAb，100ul/孔，37℃避光孵育1h；8.洗板：弃去孔内液体，PBST洗涤，4×3min，控干；9.Avidin-HRP:用1×Assaydiluent1:250稀释AV-HRP，100ul/孔，37℃避光孵育45min；10.洗板：弃去孔内液体，PBST洗涤，5×3min，控干；11.显色：1×TMBsolution，100ul/孔，37℃孵育1-30min；12.终止反应：显色完全后加2MH2SO450ul/孔，终止显色反应；于450nm处读取光密度OD值或吸光度A值；13.绘制标准曲线，分析数据2.洗涤次日，弃去孔内液体，用0.05%PBST洗板3次（将PBST加入每孔，静置3min后倾去），控干，洗去游离抗体。湿盒中，4℃过夜酶标板1.包被(NotePBST洗涤液:0.05%Tween-20-PH7.41×PBS)1×Coatingbuffer1:1000稀释CaptureAb，100μl/孔加入到酶标板中，封口膜(或保鲜膜等）封闭酶标板后，放入湿盒中，4℃过夜。1×Assaydiluent，200μl/孔加入到酶标板中，封口膜封闭酶标板后，放入湿盒中，37℃避光孵育2h。4.洗涤弃去孔内液体，用0.05%PBST洗板4次，（将PBST加入每孔，静置3min后倾去）；控干；37℃避光孵育2h3.封闭（Note1×Assaydiluent：用纯水将5×Assaydiluent稀释至1×）以上助教老师负责完成5.加样----抗原与抗体孵育1）制作标准曲线：1×Assaydiluent倍比稀释standard，每个梯度各取100μl加入酶标板，做复孔；2）待测样品：取100μl待测样品加入酶标板，做复孔；3）空白对照：取100μl1×Assaydiluent加入酶标板，做复孔；37℃避光孵育1h50ulStandard原液½¼1/81/161/32待测抗原100μl空白对照阳性对照每组4位同学的加样顺序：待测抗原100μl待测抗原100μl1.样本有4种，每人选一种做复孔2.每组做阳参2个孔3.每组做空白对照2个孔（加样1×Assaybuffer）每孔加样100μl待测抗原100μl6.洗板：弃去孔内液体，PBST洗涤，4×3min，控干；7.Biotin-DetectionAb:用1×Assaydiluent1:1000稀释detectionAb，100μl/孔，37℃避光孵育1h；8.洗板：弃去孔内液体，PBST洗涤，4×3min，控干；9.Avidin-HRP(HRP见光分解，之后所有步骤避光操作）用1×Assaydiluent1:250稀释AV-HRP，100μl/孔，37℃避光孵育45min；10.洗板：弃去孔内液体，PBST洗涤，5×3min，控干；11.显色：1×TMBsolution，100μl/孔，37℃孵育1-30min；12.终止反应：显色完全后加2MH2SO450μl/孔，终止显色反应;450nm处读取光密度0D值（或者吸光度A值）13.绘制标准曲线，分析数据结果判断定性实验显色反应后，如液体颜色变成蓝色则为阳性；仍为无色液体，则待测样品为阴性定量实验1.标准品和待测样品的OD450值减去空白孔的OD45