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第一章基因工程一.基本工具(一)限制性核酸内切酶1.分布:原核生物2.作用:一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列,并且在特定部位进行切割,使两个核苷酸间的磷酸二酯键断开。3.作用结果：产生黏性末端或平末端（二）DNA连接酶1.分类（1）E.coliDNA连接酶来源：大肠杆菌功能：只能连接黏性末端（2）T4DNA连接酶来源：T4噬菌体功能：连接黏性末端和平末端2.作用：将DNA连接起来（三）基因进入受体细胞的载体1.条件（1）具有多个限制酶切割位点，供外源基因插入（2）可自我复制或整合到染色体DNA中进行同步复制。（3）具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择2.种类：λ噬菌体的衍生物、动植物病毒、质粒质粒：双链环状DNA分子，最常用，要人工改造二。基本操作程序（一）目的基因的获取1.目的基因：编码蛋白质的基因或具有调控作用的因子2.获取方法（1）从基因文库中获取**基因组文库，部分基因文库（2）利用PCR技术扩增目的基因（3）化学方法直接人工合成：基因小，核苷酸序列已知（二）基因表达载体的构建（核心步骤）1.目的(1)稳定存在，遗传给下一代（2）表达和发挥作用2.结构：启动子、目的基因、终止子、标记基因、复制原点**启动子：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录**终止子：使转录在所需要的地方停止；**标记基因：鉴别受体细胞中是否含目的基因。（三）将目的基因导入受体细胞1.转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达2.将目的基因导入植物细胞（1）农杆菌转化法（2）基因枪法（3）花粉管通道法3.将目的基因导入动物细胞：显微注射法4.将目的基因导入微生物细胞：Ca+处理使细胞处于感受态**原核细胞特点：繁殖快，单细胞，遗传物质相对较少（四）目的基因的检测与鉴定1.分子水平的检测（1）检测受体细胞中是否插入了目的基因:DNA分子杂交技术（2）检测目的基因是否转录出了mRNA：DNA分子杂交技术（3）检测目的基因是否翻译成蛋白质：抗原—抗体杂交法**检测成功会出现杂交带2.个体生物学水平的鉴定：接种实验三．基因工程的应用1.动物、植物基因工程的成果（1）植物：提高抗逆性、改良品质、生产药物；（2）动物：品种改良、建立生物反应器、器官移植；2.基因工程药物：细胞因子、抗体、疫苗、激素；3.基因治疗（1）概念：（2）方法体外基因治疗体内基因治疗四．蛋白质工程的崛起1.理论推测，人工合成2.基因工程，蛋白合成（自然界没有的蛋白质）第二章细胞工程一.细胞工程1.原理和方法:细胞生物学和分子生物学2.操作水平:细胞水平或细胞器水平3.目的:按照人们的意愿改变细胞内的遗传物质或获得细胞产品4.分类:植物细胞工程和动物细胞工程二.植物细胞工程的基本技术(一)植物组织培养技术1.原理:植物细胞具有全能性2.条件(1)材料:离体(2)培养基:营养激素(3)外界条件:无菌等3.过程:离体组织器官脱分化愈伤组织再分化胚状体植株(二)植物体细胞杂交技术1.概念:不同种杂种细胞植物体2.原理：植物细胞具有全能性3.过程(1)制备原生质体方法①酶解法②酶:纤维素酶和果胶酶③结果:获得原生质体(2)诱导原生质体融合①方法:a物理法离心、振动、电激b化学法:聚乙二醇(PEG)②标志:杂种细胞再生出细胞壁③结果：形成杂种细胞（3）杂种细胞的筛选：AABBABAB（4）植物组织培养：杂种细胞杂种植株4.意义：克服远缘杂交不亲和的障碍**生殖方式：无性生殖变异类型：染色体数目变异（三）实际应用1.植物繁殖的新途径（1）微型繁殖：植物组织培养（2）作物脱毒：茎尖组织培养（3）人工种子：胚状体、芽+人工薄膜**可加入固氮菌、抗生素、除草剂等有利于生长和提高产量2.作物新品种的培育（1）单倍体育种（2）突变体的利用3.细胞产物的工产化生产（1）细胞产物种类蛋白质、糖类、药物、香料、生物碱（2）一般为愈伤组织时期第二课时三．动物细胞工程（一）动物细胞培养的过程细胞株细胞系取材处理单个细胞培养细胞悬浮10代细胞50代细胞原代培养传代培养1.取材：胚胎细胞或幼龄动物的组织器官2.处理：剪碎、胰蛋白酶或胶原蛋白酶3.培养：（1）培养基：液体培养基、合成培养基（2）条件①无菌无毒环境（灭菌抗生素更换）②营养:、、维生素、动物的血清、血浆③温度PH:36.5+/-0.57.2~7.4④气体环境：O2代谢所必需；CO2维持培养液PH4.原代培养：细胞贴壁、接触抑制、冷冻保存（1~10代）5.传代培养：①酶处理、分装；②细胞株：10~50代，正常③细胞系：50代以后，有癌变特点6.应用：皮肤移植、生产蛋白质制品、有毒物质的检测、研究四.动物细胞核移植和克隆动物1.概念:核移植重组胚胎个体2.原理:动物细胞核具有全能性3.分类:胚胎细胞核移植和体细胞核移植4.过程:见课本5.应用与存在的问题(1)畜牧业、保护濒危物种、医药卫生、治疗疾病、器官移植(2)问题:成功率低健康问题食品安全问题五.动物细胞融合1.概念:2.原理:细胞膜的流动性3.方法(1)物理法(2)化学法(3)生物法：灭活的病毒4.意义：5.用途：制备单克隆抗体六.单克隆抗体1.概念:化学性质单一,特异性强的抗体2.制备过程(1)免疫动物：注入特定抗原(2)细胞融合：灭活病毒(3)筛选杂交瘤细胞①用选择培养基筛选出杂交瘤细胞②抗体—抗原杂交检测出能产生特定抗体的杂交瘤细胞(4)生产并提纯单克隆抗体①体内：动物腹腔②体外：液体培养基3.优点:特异性强灵敏度高能大量制备应用:(1)诊断(2)治疗:生物导弹第三章胚胎工程一．精子的发生1.场所：睾丸2.时间：初情期生殖机能衰退有丝分裂精原细胞3.过程：精原细胞MIMII精细胞变形精子4.变形：细胞核头部高尔基体頂体中心体尾部线粒体线粒体鞘其他物质原生质滴（脱落）**精子的大小与动物体型的大小无关二．卵子的发生1.场所：卵巢输卵管2.时间：胎儿期初情期3.过程：（1）胎儿期卵原细胞有丝分裂卵原细胞复制卵泡形成：初级卵母细胞+卵泡细胞（卵巢）卵巢MI（2）初情期排卵次级卵母细胞+第一极体（输卵管）受精输卵管MII合子+第二极体**卵子发生过程中MIMII不连续**初级卵母细胞周围形成透明带**卵子受精的标志:卵细胞膜与透明带间可观察到两个极体**精卵发生的重要区别：胎儿期卵泡的形成和储备三．受精1.场所：输卵管2.过程：（1）精子获能：场所为雌性生殖道内（2）卵子准备：发育至MII中期（3）受精阶段：①精子穿越放射冠和透明带a頂体反应：释放頂体酶b透明带反应：防止多精入卵受精（第一道屏障）②进入卵细胞膜a时间：精子入卵后b作用：防止多精入卵受精（第二道屏障）③原核形成和融合a精子头尾分离形成雄原核b受精后MII，排极体，形成雌原核c雄原核与雌原核融合四．胚胎发育（一）卵裂1.受精卵：个体发育的起点2.桑椹胚：之前细胞具有全能性3.囊胚：开始分化内细胞团（个大)滋养层(个小)具有囊胚腔***卵裂特点:有丝分裂细胞增多总体积不变或缩小***孵化:透明带破裂(二)原肠胚(1)内细胞团:外胚层内胚层原肠腔组织器官(2)滋养层:胎盘和胎膜第二课时胚胎工程一．体外受精五．卵母细胞的采集和培养1.小型动物（1）处理：促性腺激素超数排卵（2）场所：输卵管中冲取卵子2.大型动物（1）场所：卵巢（2）培养：人工培养至MII中期（二）精子的采集和获能1.收集精子的方法（1）假阴道法（2）手握法（3）电刺激法2.精子获能的方法（1）培养法：获能液（2）化学诱导法：肝素或钙离子载体A23187溶液+化学药物（三）受精：获能溶液或专用的受精溶液二．胚胎的早期培养1.发育培养液（1）成分：有无两素两酸血清（2）继续发育检查发育能力2.结果：早期胚胎三．胚胎移植的生理基础1.发情处理后，供体、受体生殖器官的生理变化相同2.早期胚胎处于游离状态，可收集3.受体对外来胚胎基本上不发生免疫排斥反应4.孕育过程中胚胎的遗传特性不受影响四．胚胎移植的基本程序1.对供体、受体的选择和处理（1）选择①供体：遗传性能和生产性能优秀②受体：体质和繁殖能力正常（2）处理①性激素：同期发情处理②促性腺激素：超数排卵2.配种或人工受精3.对胚胎的收集、检查、培养或保存①收集：子宫中冲卵②检查：桑椹胚或囊胚③保存：-196℃液氮4.胚胎移植（1）手术法（2）非手术法5.妊娠检查、分娩****优势：充分发挥雌性优良个体的繁殖能力五．胚胎分割1.概念：机械2n移植2.生殖方式：无性生殖3.仪器设备：实体显微镜和显微操作仪4.分割时期：发育良好形态正常的桑椹胚或囊胚**囊胚分割时注意将内细胞团均等分割**性别鉴定和胚胎分割取材部位不同5.意义：提高胚胎利用率六．胚胎干细胞1.来源：早期胚胎细胞和原始性腺2.特性（1）形态：细胞体积小、核大、核仁明显（2）功能：细胞具有全能性****体外培养只增殖而不分化3.应用：体外诱导分化治疗疾病用于研究