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紫外—可见吸收光谱现代分析技术研究中心赵娟跨越众多领域，提供完美技术分析装置测定装置试验检查装置真空机器医疗器械等紫外-可见分光光度法原理(UltravioletandVisibleSpectrophotometry,UV-Vis)2.1紫外-可见吸收光谱2.2吸收光谱的测量-----Lambert-Beer定律2.3分析条件选择2.4UV-Vis分光光度法的应用UV-Vis方法是分子光谱方法，它利用分子对外来辐射的吸收特性。UV-Vis涉及分子外层电子的能级跃迁；光谱区在160~780nm.UV-Vis主要用于分子的定量分析，但紫外光谱(UV)为四大波谱之一，是鉴定许多化合物，尤其是有机化合物的重要定性工具之一。电磁波谱g-X-射线紫外可见红外微波无线电20040080010000(nm)波长真空紫外近红外核磁共振波长越短，能量越高引起UV/VIS吸收的原因某些单键大多数双键共轭双键某些金属与非金属化合物N,O,S,卤素2.1紫外-可见吸收光谱一、分子吸收光谱的形成1.过程：分子外层电子--------吸收外来辐射------产生电子能级跃迁-----分子吸收谱。hMhMtII*0基态E0激发态E1DE=E1-E0=h能量激发e能量差DE有机分子包括:成键轨道、；反键轨道*、*；非键轨道n；可能的跃迁类型：-*；-*；-*；n-*；-*；n-*二、分子吸收光谱跃迁类型n非成键轨道成键轨道*反键轨道成键轨道*反键轨道Energylevelσ-σ*跃迁，能量很高。电子以单键存在，如饱和碳氢化合物，一般在波长220nm时无强的紫外吸收；n-σ*跃迁，能量相对较高。化合物中含有非键合的O，N，S，或X-的电子。在紫外区有强吸收；π-π*跃迁、n-π*跃迁，能量较低。含有双键，螯合双键芳香烃，闭环芳香烃及杂环芳香烃的化合物。紫外和可见区有中等至强的吸收。只有-*和n-*两种跃迁的能量小，相应波长出现在近紫外区甚至可见光区，且对光的吸收强烈，是我们研究的重点。-胡罗卜素咖啡因阿斯匹林丙酮几种有机化合物的分子吸收光谱图。2.2吸收光谱的测量-----Lambert-Beer定律一、透射率入射光I0透射光I光程长b透射率T%=II0X100%二、Lambert-Beer定律当入射光波长一定时，待测溶液的吸光度A与其浓度和液层厚度成正比，即k为比例系数，与溶液性质、温度和入射波长有关。当浓度以g/L表示时，称k为吸光系数，以a表示，即当浓度以mol/L表示时，称k为摩尔吸光系数，以表示，即比a更常用。越大，表示方法的灵敏度越高。与波长有关，因此，常以表示。A=-lgT%=lgI0/I=KbcabcAbcA三、偏离L-B定律的因素样品吸光度A与光程b总是成正比。但当b一定时，A与c并不总是成正比，即偏离L-B定律！这种偏离由样品性质和仪器决定。1.样品性质影响a）待测物高浓度--吸收质点间隔变小—质点间相互作用—对特定辐射的吸收能力发生变化---变化；b）试液中各组份的相互作用，如缔合、离解、光化反应、异构化、配体数目改变等，会引起待测组份吸收曲线的变化；c）溶剂的影响：对待测物生色团吸收峰强度及位置产生影响；d）胶体、乳状液或悬浮液对光的散射损失。浓度影响适用于稀溶液高浓度区偏离线形范围(0.01M)Highconcentrationmoremoleculesarepackedinonevolume化学反应影响Deviationfromlinearitymaycausedby–分析物分解–分析物缔合–分析物与溶剂发生反应杂散光影响1.02.002.55.07.510.0Concentration,M*103Absorbance0.0%0.2%1.0%5.0%Straylight=*100IsIoDiagramwastakenfrom:DouglasA.SkoogandJamesJ.Leary,PrinciplesofInstrumentalAnalysis,4thed.,SaundersCollegePublishing,1992,page131.pH值的影响Diagramtakenfrom:JamesD.IngleJr.andStanleyR.Crouch,SpectrochemicalAnalysis,prentice-HallInternationalEditions,page3741.00.90.80.70.60.50.40.30.20.10325400475550625700(nm)Absorbance10986.869876.86.56酚红不同pH值的吸收2.3分析条件选择一、仪器测量条件当分析高浓度的样品时，误差更大。由L-B定律：微分后得：将上两式相比，并将dT和dc分别换为DT和Dc，得当相对误差Dc/c最小时，求得T=0.368或A=0.434。即当A=0.434时，吸光度读数误差最小！通常可通过调节溶液浓度或改变光程b来控制A的读数在0.15~1.00范围内。bcTAlgbdcTdTTd434.0lgTTTcclg434.0DD二、反应条件选择1.显色剂的选择原则：使配合物吸收系数最大、选择性好、组成恒定、配合物稳定、显色剂吸收波长与配合物吸收波长相差大等。2.显色剂用量：配位数与显色剂用量有关；在形成逐级配合物，其用量更要严格控制。3.溶液酸度：配位数和水解等与pH有关。4.显色时间、温度、放置时间等。三、参比液选择1.溶剂参比：试样组成简单、共存组份少（基体干扰少）、显色剂不吸收时，直接采用溶剂（多为蒸馏水）为参比；2.试剂参比：当显色剂或其它试剂在测定波长处有吸收时，采用试剂作参比（不加待测物）；3.试样参比：如试样基体在测定波长处有吸收，但不与显色剂反应时，可以试样作参比（不能加显色剂）。四、干扰消除1.控制酸度：配合物稳定性与pH有关，可以通过控制酸度提高反应选择性，副反应减少，而主反应进行完全。如在0.5MH2SO4介质中，双硫腙与Hg2+生成稳定有色配合物，而与Pb2+、Cu2+、Ni2+、Cd2+等离子生成的有色物不稳定。2.选择掩蔽剂3.合适测量波长4.干扰物分离5.导数光谱及双波长技术二、定量分析1.单组份定量方法1）标准曲线法（略）2）标准对比法：该法是标准曲线法的简化，即只配制一个浓度为cs的标准溶液，并测量其吸光度，求出吸收系数k，然后由Ax=kcx求出cx该法只有在测定浓度范围内遵守L-B定律，且cx与cs大致相当时，才可得到准确结果。校正曲线Analyteconcentration(ppm)AbsorbanceSlopem=lAbs=m*Concentration+K0紫外可见分光光度计UV2550紫外-可见分光光度计的结构紫外-可见分光光度计的基本结构是由五个部分组成：光源单色器吸收池检测器数据系统紫外-可见分光光度计的结构（一）光源热辐射光源用于可见光区，如钨丝灯和卤钨灯，钨灯和碘钨灯可使用的范围在340－2500nm；气体放电光源用于紫外光区，如氘灯。它可在160－375nm范围内产生连续光源。氘灯的灯管内充有氢的同位素氘，它是紫外光区应用最广泛的一种光源。氘灯：紫外区，190nm-光源转换波长（282-393nm）钨灯：可见-近红外，光源转换波长-3200nm（二）单色器单色器主要功能：产生光谱纯度高的波长且波长在紫外可见区域内任意可调。单色器一般由入射狭缝、准光器、色散元件、聚焦元件和出射狭缝等几部分组成。单色器的性能直接影响入射光的单色性，从而也影响到测定的灵敏度、选择性及校准曲线的线性关系等。狭缝的大小直接影响单色光纯度，但过小的狭缝又会减弱光强。紫外-可见分光光度计的结构AFM显微镜下的光栅图像（三）吸收池吸收池用于盛放分析试样，一般有石英和玻璃材料两种。石英池适用于可见光区及紫外光区，玻璃吸收池只能用于可见光区。为减少光的损失，吸收池的光学面必须完全垂直于光束方向。在高精度的分析测定中（紫外区尤其重要），吸收池要挑选配对。因为吸收池材料的本身吸光特征以及吸收池的光程长度的精度等对分析结果都有影响。（四）检测器常用的检测器有光电池和光电倍增管等。硅光电池对光的敏感范围为190-1100nm。但由于容易出现疲劳效应而只能用于中低档的分光光度计中。光电倍增管是检测微弱光最常用的光电元件，它的灵敏度比一般的光电池要高200倍，因此可使用较窄的单色器狭缝，从而对光谱的精细结构有较好的分辨能力。紫外可见区：光电倍增管（PMT）近红外区：PbS光电池切换波长：750-895nm（五）数据系统它的作用是放大信号并以适当方式指示或记录下来。现在一般的紫外可见分光光度计有计算机控制和主机单片机控制两种类型，功能基本类似。紫外-可见分光光度计的类型很多，但可归纳为三种类型，即单光束分光光度计、双光束分光光度计和比例双光束分光光度计。1，单光束分光光度计经单色器分光后的一束平行光，轮流通过参比溶液和样品溶液，以进行吸光度的测定。这种简易型分光光度计结构简单，操作方便，维修容易，适用于常规分析。2，双光束分光光度计经单色器分光后经反射镜分解为强度相等的两束光。紫外-可见分光光度计的类型一束通过参比池，一束通过样品池。光度计能自动比较两束光的强度，此比值即为试样的透射比，经对数变换将它转换成吸光度并作为波长的函数记录下来。双光束分光光度计一般都能自动记录吸收光谱曲线。由于两束光同时分别通过参比池和样品池，还能自动消除光源强度变化所引起的误差。3，比例双光束分光光度计由同一单色器发出的光被分成两束，一束直接到达检测器，另一束通过样品后到达另一个检测器。这种仪器的优点是可以监测光源变化带来的误差，但是并不能消除参比造成的影响。常见附件比色皿（长光程、短光程，微量池）池架（4联，恒温，微量）自动分析（Sipper）积分球软件分析混浊、固体、不透明样品的积分球