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细胞传代培养及细胞计数人癌细胞系传代培养•1.观察：培养细胞生长活跃，占瓶底80%-90%，无污染；•2.弃废液：倒掉瓶中培养液，尽量沥干液体；•3.漂洗：加1ml0.25%胰蛋白酶消化液漂洗1次,弃去消化液；•4.消化：再加1ml消化液漂洗1次,倒掉大部分消化液,保留约0.3ml,室温放置3～5min；•5.吹打：镜下看到细胞收缩变园,加1～2ml含血清培养液,用吸管按顺序轻轻吹打，避免出现泡沫；•6.计数：取样,计数,调整细胞浓度；•7.接种及培养：按104细胞/ml接种,37℃、5%CO2，饱和湿度条件下培养。注意事项•细胞生长至覆盖培养瓶底面积80%左右时,开始传代。•首次传代培养应适当提高接种细胞浓度。•细胞混杂生长时,可根据需要选择合适的方法纯化细胞。血球计数板法•制备细胞悬液：细胞密度＞104/ml,细胞过多时需适当稀释,单个细胞率95%。•加样：混悬细胞，取少许细胞悬液，从计数池一侧加入，不要溢出或出现气泡。•计数：10倍物镜下计数四角大方格内的细胞，压线者只计左边线和上边线。•计算：细胞数/ml=（四大格细胞总数／4）×104×稀释倍数细胞活力测定－台盼蓝染色法•制备单个细胞悬液：105～106／ml•染色：0.04%台盼蓝染色1min(9滴细胞悬液＋1滴0.4%台盼蓝)，3min内计数•计数：用血细胞计数板镜下分别计数活细胞（染料拒染）和死细胞（呈淡蓝色）•计算细胞活力：活细胞率（％）＝［活细胞数／（活细胞数＋死细胞数）］×100细胞密度调整•稀释公式：C1·V1＝C2·V2稀释前细胞密度C1，溶液体积V1稀释后细胞密度C2，溶液体积V2细胞计数106/mlCellsusspension105/ml104/ml103/ml0.1ml0.1ml0.1mlMedium0.9ml细胞生长曲线测定－计数法01020304050607080012345678DaysincultureCellnumber（X104）M3SP2M3SP2-pBpM3SP2-PTENDT=t×lg2÷(lgNt－lgNo)培养细胞的纯化方法•机械刮除法：用细胞刮刮出不需要的细胞•差速粘附法：成纤维样细胞，上皮样细胞•选择性酶消化法：金属管套取需要的细胞•密度梯度离心法：细胞漂浮密度，Ficoll,Percoll•克隆化培养法：琼脂法，有限稀释法•免疫磁珠分离法：细胞表面标志，免疫磁珠•速度沉降法：细胞大小，离心淘洗技术•电泳分离法：细胞表面电荷细胞培养过程中常见的问题•培养液pH值快速偏离：CO2浓度异常，培养瓶盖过紧；细菌、酵母或霉菌污染•培养液出现沉淀：细菌或霉菌污染•细胞不贴壁：胰酶过度消化细胞，支原体污染，缺乏附着因子•细胞死亡：孵箱中缺CO2，孵箱温度不稳定，细胞冻融损伤，渗透压改变，培养液中毒性代谢产物堆积•细胞生长缓慢：培养液或血清改变，基本促生长成分的消耗、缺乏或降解,如谷氨酰胺、生长因子等，低水平的细菌或霉菌污染，接种细胞数太少，有限培养细胞衰老，支原体污染