生物化学4抗体制药

第四章抗体制药4.1概述4.2单克隆抗体4.3基因工程抗体4.4多功能抗体4.5抗体库技术4.6抗体诊断试剂4.7抗体治疗药物4.1概述抗体（antibody）：能与相应抗原特异性结合的免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）。抗体通过以下途径中和和除去有害物质：直接使抗原失去活性促使免疫效应细胞将其吞噬并加以破坏使抗原表面弱化而易于受补体破坏结晶片段FragmentcrystallizableIgM,IgG,IgA,IgD,IgE抗原结合片段fragmentofantigenbinding110aa抗体研究的3个阶段：1、多克隆抗体含针对多个不同抗原决定簇的不同抗体不同淋巴细胞产生、针对同一抗原区存在多种抗体中和外源性毒素（蛇毒、白喉毒素）非特异性交叉反应不能应用肿瘤和其他疾病治疗。2、单克隆抗体（monoclonalantibody，McAb）仅识别单一抗原决定簇由同一细胞产生高度特异性、均一性、来源稳定可大量生产。McAb（monoclonalantibody）在临床上主要用于诊断和治疗：疾病的诊断检测某疾病相关的抗原（ELISA）治疗抑制器官移植排斥（抗分化抗原CD3单抗）作为药物载体对肿瘤进行定向治疗McAb在免疫导向疗法中存在的问题（障碍）：A、鼠源性，产生人抗鼠抗体（HAMA，humanantimouseantibody），排斥反应，半衰期短，难维持有效药物作用靶组织时间；B、相对分子质量过大，难以穿透实体肿瘤组织，达不到有效的治疗浓度。需要解决的问题A、降低McAb的免疫源性B、降低McAb的相对分子质量3、基因工程抗体人源化抗体（嵌合抗体，chimericantibody；改形抗体，reshapingantibody；等）基因工程抗体片断（单链抗体，scFv，singlechainantibody；单域抗体VH或VL等）抗体片断只保留了与抗原特异结合的能力，Fc片断所具有的补体激活、免疫调理等各种生物功能丧失。4.2单克隆抗体McAb是将抗体产生细胞与具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞融合，通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一的单克隆细胞系而产生的抗体。培养上清中X抗体的检测克隆化培养单克隆杂交瘤细胞培养上清中X抗体的检测杂交瘤细胞可持续分泌单克隆抗体规模化培养获得大量单克隆抗体动物免疫细胞融合混合细胞的HAT筛选)分泌X抗体B淋巴细胞骨髓瘤细胞X抗原B淋巴细胞瘤的突变株培养数天后细胞死亡无限生长细胞分泌X抗体只有杂交瘤细胞可长期存活下来BALB/c杂交瘤技术操作流程图解一、抗原与动物免疫抗原：•种类上无限制（纯化分子、病毒、细菌、细胞等）•纯度无绝对要求（尽可能高纯度抗原）动物：骨髓瘤细胞系同品系动物（BALB/c小鼠和Lou大鼠）免疫方法：•体内免疫皮下、肌肉及腹腔免疫颗粒性抗原（无需佐剂）可溶性抗原（加佐剂）•脾内免疫手术暴露脾脏，直接注入来源有限、昂贵抗原免疫效果差•体外免疫从脾脏或外周血中分离淋巴细胞，加入抗原共培养4~5天。二、细胞融合与杂交瘤细胞的选择培养骨髓瘤细胞：自身不合成或不分泌任何免疫球蛋白分子或片断。HGPRT-（次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶）融合过程：取脾细胞（1*108）与骨髓瘤细胞（2*107~3*107）进行混合，在PEG作用下诱导它们融合，时间控制在2min以内，然后用培养液将PEG融合液缓慢稀释。HAT选择性培养基培养动物细胞核苷酸合成两条途径：全合成途径、补救合成途径氨基喋呤（Aminopterine，A）为四氢叶酸的结构类似物，能够和二氢叶酸还原酶（能够将二氢叶酸还原生成四氢叶酸）发生不可逆结合，阻止了四氢叶酸（核苷酸生物合成的甲基供体）的生成。从而阻断了阻断GMP、TMP的生物合成。GMP、TMP的补救合成途径：GMP可以在HGPRT（次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶）的作用下由次黄嘌呤（hypoxanthine，H）合成。TMP可以在TK(胸苷激酶)的作用下，由胸腺嘧啶（thymine,T）合成。A:氨基喋呤H:次黄嘌呤T:胸腺嘧啶抗原免疫小鼠HGPRT-骨髓瘤细胞PEG脾B细胞HAT培养基选择培养B-瘤（2周）B、B-B、瘤、瘤-瘤、B-瘤瘤细胞无补救途径，同时全合成途径被A阻断，不能存活；B细胞具有补救途径但不能长期存活；B-瘤细胞具有补救途径又可长期存活三、筛选阳性克隆与克隆化检测方法：免疫酶技术（ELISA常用）、免疫荧光技术、放射免疫技术克隆化克隆化方法：有限稀释法和软琼脂法。•有限稀释法：杂交瘤细胞悬液稀释后，加入到96孔板，使每孔中在理论上只含有一个细胞。•软琼脂法：在培养液中加入0.5%的琼脂糖凝胶，细胞分裂后形成小球样团块，培养基为半固体状态，可用吸管吸出，移入96孔板培养。加入饲养细胞杂交瘤细胞染色体不稳定，易丢失，反复克隆化，3～4次，至各孔100%抗体阳性四、杂交瘤细胞与抗体性状的鉴定1、染色体分析正常鼠的脾细胞染色体数：40，全部为端着丝粒。小鼠骨髓瘤细胞染色体：SP2/0细胞为62~68，NS-1为54~64，大多数为非整倍性，有中部和亚中部着丝点。杂交瘤细胞的染色体数目：接近两亲本细胞染色体数目的总和，在结构上多数为端着丝粒染色体外，还应出现少数标志染色体。染色体数目多且较集中的杂交瘤细胞分泌高效价的抗体；反之，则反2、分泌抗体稳定性分析连续传代，检测上清中抗体浓度；一般需3个月。3、Ig类别及亚类鉴别羊或兔抗Ig不同类或亚类的抗体免疫扩散或ELISA。4、亲和力测试高亲和力：体内应用或检测试剂低亲和力：亲和层析5、抗原识别位点等其他测试Ig抗IgG1抗体抗IgG2抗体抗IgA抗体抗IgD抗体抗IgE抗体五、单克隆抗体的大量制备1、动物体内诱生法5~20mg/ml抗体基本程序：接种前1~2周，同品系鼠腹腔注射0.5ml降植烷或液体石蜡，然后注射1*106杂交瘤细胞，7~12d便有腹水生成后注射器抽取，离心去细胞沉淀即得单抗腹水，每只小鼠可得3~5ml。优点：操作简便，比较经济，抗体浓度高，多用于研究和诊断等一般用途，为一般用途单抗制备首选。缺点：混有来自小鼠的非特异性抗体，给纯化带来难度。2、体外培养法悬浮培养、微载体培养等动物细胞大规模培养方式抗体浓度比动物体内诱生发低用于防病治病单抗的工业化生产最好采用无血清培养六、单克隆抗体的纯化根据Ig的类和亚类以及用途选择不同的纯化方法：•体外诊断试剂IgG类-----沉淀处理+亲和层析•IgM类------沉淀处理+凝胶过滤•体内诊断试剂或治疗用药-----亲和层析+阴离子交换层析六、单克隆抗体的纯化动物体内诱生法制备的McAb纯化的一般程序：（1）澄清和沉淀处理：1.1~1.9%正辛酸等电点沉淀白蛋白（血清中主要杂蛋白),再硫酸铵沉淀。小鼠腹水90%以上的单克隆抗体离心力为1000g离心5min离心力20000g高速离心30min0.2um微孔过滤膜50%饱和硫酸铵沉淀（2）分离•凝胶过滤用于IgG和IgM类。SephadexG2003个峰，分子量最高峰为IgM，另外两个峰为IgG。抗体回收率50~80%，纯度可达95%以上。•阴离子交换层析适用于IgG类的分离纯化。•亲和层析适用于IgG类蛋白A（proteinA,金黄色葡萄球菌）蛋白G（proteinG，G群链球菌）IgG的Fc片断蛋白A、蛋白G与不同属来源的抗体结合强度不同pH8.0结合在亲和柱降低pH至2.5~3之间进行洗脱细胞培养液中单抗的浓缩：离心或过滤亲和层析IgG超滤4.3基因工程抗体互补性决定区(CDR，complementaritydeterminantregion)骨架区（FR,frameregion）Vk1一、嵌合抗体（chimericantibody）将鼠源单克隆抗体可变区和人抗体恒定区连接起来的抗体。免疫原性大幅度降低。保留抗原结合特异性。构建过程：提取杂交瘤细胞mRNA反转录成cDNART-PCR分别扩增VL、VH基因表达载体共转染骨髓瘤细胞分别与人的轻链、重链恒定区基因相连人-鼠嵌合抗体15~16aa二、改形抗体（reshapingantibody）抗原结合区域：H和L链V区中的互补性决定区(CDR，complementaritydeterminantregion)将鼠源性单克隆抗体的CDR以外序列替换人Ig分子中的序列，可基本消除免疫原性。改型抗体也称CDR移植抗体(CDRgraftingantibody)。15~16aa构建过程：分别RT-PCR克隆杂交瘤细胞H、L链可变区基因并测序设计改形抗体可变区基因化学合成可变区基因表达载体共转染骨髓瘤细胞分别与人的轻链、重链恒定区基因相连改形抗体15~16aa问题：抗体亲和力下降原因：骨架区（FR,frameregion）影响CDR的空间结构。提高亲和力：•从已知人可变区数据库中选择骨架区与鼠抗骨架区同源性最高的序列•骨架区内可能影响抗原结合的氨基酸残基替换为鼠抗残基：立体结构数据、结构预测、分子设计推测•合适保留CDR两侧骨架区序列大都涉及VL、VH相互作用以及与CDR接触•选择性保留可变区N末端的数个氨基酸残基N末端与CDR表面相距很近，可能参与抗原结合三、镶面抗体（resurfacingantibody）抗体可变区表面暴露的氨基酸残基位置和数量非常保守，不因种属和型别改变。为免疫原性主要来源将鼠抗可变区表面暴露的骨架区氨基酸残基改为相应的人源残基，使可变区表面人源化。消除异源性，保持单抗特异性和亲和力。四、小分子抗体1.Fab片断（fragmentofantigenbinding）完整轻链和重链Fd段（单价）完整抗体的1/3木瓜蛋白酶水解抗体重组方式生产抗原特异性、制作简单2.Fv与单链抗体（singlechainFv，ScFv）（1）Fv（可变区片断）VL、VH非共价键结合（单价）完整抗体的1/6基因工程重组生产易解离（2）ScFv常用连接肽：(Gly4Ser)3优点：•分子量小（1/6），免疫原性低•容易进入瘤体组织•无Fc，免疫诊断成像清晰，本底低•单链容易改造•可采用大肠杆菌大量生产缺点：•单价，亲和力下降•半衰期短，体内清除过快•功能单一，仅能与一种抗原结合•可形成scFv二聚体和多聚体3.单域抗体VH或VL仍保留了抗原结合活性亲和力低4.分子识别单位（MRU，molecularrecognitionunit）单个CDR区亲和力相当低4.4多功能抗体一、双功能抗体(bispecificantibody,BsAb)具有两种抗原结合特性主要指双特异性单链抗体(bispecificsingle-chainFvs,BsFvs)构建双特异性单链抗体的方式：•末端半胱氨酸残基共价交联大肠杆菌表达•链间连接肽相连•微型抗体利用专门的二聚化结构域将两scFv连接成异二聚体亮氨酸拉链（a螺旋每两圈7个氨基酸出现一个亮氨酸，位于同一侧）转录因子Fos和Jun蛋白中含亮氨酸拉链，形成稳定Fos-Jun二聚体其他二聚体结构：螺旋-转角-螺旋等•双体形式短连接肽（3~12aa）:同一scFv分子内VH和VL内不能配对，只能和另一分子VH和VL配对，形成双体分子。双特异性抗体的应用：•在免疫诊断中应用两抗原结合位点分别设计为针对靶抗原和酶分子可取代酶标抗体优点：不需要标记抗体，避免化学交联抗体和酶对蛋白的损伤，生物活性高，可大量制备，应用方便。例（肝癌等癌症诊断）：抗辣根过氧化物酶(HRP)-抗甲胎蛋白（AFP）双特异性抗体ELISA检测AFP最低浓度5ng/mL•在肿瘤放射免疫显像中应用一端针对肿瘤细胞表面的抗原一端能与带放射性核素的半抗原结合二次导向：先注入双特异性抗体定位肿瘤，一定时间后游离抗体被清除注入放射性核素的半抗原，定位于肿瘤细胞与常规放射免疫显像比，可提高清晰度和灵敏度•双特异性抗体介导的药物杀伤效应常规肿瘤导向：单抗与化疗药物、毒素或放射性核素偶联导致抗体或偶联药物失活双特异性抗体很好避免这点•双特异性抗体介导的细胞杀伤效应一端针对肿瘤细胞表面的抗原一端针对免疫活性细胞表面的效应分子，活化该细胞二、多功能抗体将sc