荧光分光光度计课件

2020/4/5光学分析仪器培训1光学分析仪器（2）荧光分光度计的原理与应用技术2020/4/5光学分析仪器培训2荧光分光光度法光的基本性质光是一定波段范围的电磁波，具有波粒二象性。光的波动性可用波长、频率、光速c、波数（cm-1）等参数来描述：=c；波数=1/=/c光的粒子性说明光是有能量的：E=h=hc/（Planck常数：h=6.626×10-34J×S)1、荧光分光光度法简介2020/4/5光学分析仪器培训3荧光分光光度法光学分析仪器主要是通过电磁波与物质互作用后，物质对电磁辐射产生吸收或再发射，测量所得到的信息来对物质加以研究的分析仪器。这方面的仪器很多，在这里我们主要对紫外—可见分光光度计和荧光分光光读计加以讨论。1、荧光分光光度法简介2020/4/5光学分析仪器培训4荧光分光光度法光学分析仪器因为物质对光的选择性吸收的特点，他的吸收有如下的特性M+hM*M+热基态激发态M+荧光或磷光1、荧光分光光度法简介2020/4/5光学分析仪器培训5荧光分光光度法原子发射光谱法：原子荧光分析发射光谱法分子发射光谱法：荧光分析、磷光分析光谱分析法原子吸收光谱法：原子吸收分光分析吸收光谱法分子吸收光谱发：紫外可见、红外吸收光谱1、荧光分光光度法简介2020/4/5光学分析仪器培训6荧光分光光度法荧光分光光度法荧光现象早在16世纪就比发现，但对荧光产生的原理和条件直到19世纪才基本清楚。Stokes在1852年考察了奎宁和叶绿素的荧光后发现，他们的荧光波长要比照射的波长要长。认定是物质吸收光能后重新发射的光，并且波长不同，荧光是发射光才被证实。1、荧光分光光度法简介2020/4/5光学分析仪器培训7荧光分光光度法荧光分光光度法当用紫外光照射某种物质时，这些物质会发出各种颜色和不同强度的光，当紫外光停止照射时，这种光线也随之消失。我们这种光线称为荧光。依据物质所发荧光的颜色和强度建立起来的定性和定量的分析方法称为荧光分光光度法。1、荧光分光光度法简介2020/4/5光学分析仪器培训8荧光分光光度法荧光的产生：荧光是一种自然现象，在我们的日常生活中到处可以看见。产生荧光的原因是：荧光物质分子吸收了特征频率的能量后，由基态跃迁到激发态，然后内能转换消耗部分能量，返回到最低电子激发态的最低振动能级，再从这个能级返回基态时所发的光，这束光我们称为荧光。荧光发射的能量要比吸收光的能量小（波长要长）。在这里我们用分子能级图就能够很好的理解它的产生过程。1、荧光分光光度法简介2020/4/5光学分析仪器培训9荧光分光光度法分子能级图：1、荧光分光光度法简介2020/4/5光学分析仪器培训10荧光分光光度法2、荧光分光光度计的基本结构F-7000荧光分光光度计2020/4/5光学分析仪器培训11荧光分光光度法荧光分析仪器的结构和主要部件：2、荧光分光光度计的基本结构光源样品池激发单色器检测器数据处理仪器控制发射单色器2020/4/5光学分析仪器培训12荧光分光光度法2、荧光分光光度计的基本结构2.1、光源：对光源的要求是必须有足够的强度且具有连续光谱，其波长范围能满足仪器的需要。大部分仪器由氙灯组成,它对能量的要求没有紫外可见分光光度计那么严格。2020/4/5光学分析仪器培训13荧光分光光度法氙灯光源2、荧光分光光度计的基本结构波长范围：200~1000nm工作压力：5~20atm启动电压：20~40KV使用寿命：1000~2000h2020/4/5光学分析仪器培训14荧光分光光度法2、荧光分光光度法简介2.2、单色器：色器也是荧光分光度计的核心部件。它有两个单色器。激发单色器它的作用是将光源发出的白色光色散成各种波长的单色光用于照射样品，发射单色器的作用只让样品发出的荧光通过。2020/4/5光学分析仪器培训15荧光分光光度法2、荧光分光光度计的基本结构2.3、样品室样品室比较宽大，以容纳各种光径的样品池和附件。如流动池，微量池等。样品池全用石英材料制成，没有玻璃样品池。2020/4/5光学分析仪器培训16荧光分光光度法F-7000荧光分光光度计样品室2、荧光分光光度计的基本结构2020/4/5光学分析仪器培训17荧光分光光度法2、荧光分光光度计的基本结构紫外-可见分光光度计测量池(吸收池)荧光分光光度计样品池I0ItI0ItIF,p2020/4/5光学分析仪器培训18荧光分光光度法2、荧光分光光度计的基本结构2.4、检测器荧光分光光度计常用的是光电检测器。如光电池、光电管、光电倍增管和二极管阵列检测器。现在大部分是光电管2.5、数据测量和控制：控制仪器，并把测量到的荧光强度显示出来。2020/4/5光学分析仪器培训19荧光分光光度法2、荧光分光光度计的基本结构2.3、样品室样品室比较宽大，以容纳各种光径的样品池和附件。如流动池，微量池等。样品池全用石英材料制成，没有玻璃样品池。2020/4/5光学分析仪器培训20荧光分光光度法荧光分光光度计于紫外-可见分光光度计的区别2、荧光分光光度计的基本结构2020/4/5光学分析仪器培训21荧光分光光度法3、荧光分光光度法的特点3.1、特点有以下几点：（1）灵敏度高荧光分析的最大特点是灵敏度高，通常比紫外可见光度计高出2—3个数量级。（2）选择性强荧光光谱包括激发光谱和发射光谱。因此确定恰当的激发光谱和发射波长，能达到很高的选择。2020/4/5光学分析仪器培训22荧光分光光度法3、荧光分光光度法的特点（3）试样量少和方法简单由于荧光分析法灵敏度高，因而分析时需试样量较小。特别在使用微量池时，用样量可以大大减小。（4）能获得更多的信息荧光分析可提供激发光谱、发射光谱、荧光强度、总荧光量、峰位、谱带宽度、量子产率、荧光寿命等参数。2020/4/5光学分析仪器培训23荧光分光光度法3、荧光分光光度法的特点（5）受外界影响较大，外界因素如温度、PH值、溶剂和其它因素都可能显著地影响分析结果。其中温度对他的影响最大，这也是荧光分析需标准的原因。2020/4/5光学分析仪器培训24荧光分光光度法3、荧光分光光度法的特点3.2、荧光分光光度法的发展近年来，荧光分光度计随着新技术的的采用，发展非常快，特别是计算机和其它先进技术应用的引入，是荧光光度计发生了根本的变化，相应的分析方法也得到很快的发展，象激光荧光分析技术、时间分辨荧光分光光度法、同步荧光分析法，这些又大的推动了分析方法在理论和应用方面的进展。同时促进荧光分析技术的不断完善。2020/4/5光学分析仪器培训25荧光分光光度法3、荧光分光光度法的特点3.3、荧光和分子的关系：荧光和分子结构的关系是个比较重要而复杂的问题，但是，由于对激发态分子的性质了解得不多，所以对他们的关系还不十分清楚。一般来说，能发出荧光的物质具有较大的吸收光能力、较高的荧光量子效率和合适的环境。分子中含有能发荧光的基团称为荧光团。对于能产生荧光的物质与分子结构之间关系的描述可简单的总结以下几点，仅供参考。2020/4/5光学分析仪器培训26荧光分光光度法3、荧光分光光度法的特点3.3、荧光和分子的关系：3.3.1、有机物的荧光（1）共轭效应：具有共轭双键的芳环或杂环化合物，其电子共轭程度越大，越容易产生荧光;环越多，发光峰红移程度越大,发光也越强。同一共轭环数的芳族化合物，线性环结构的荧光波长比非线性者要长。2020/4/5光学分析仪器培训27荧光分光光度法3、荧光分光光度法的特点3.3、荧光和分子的关系：（2）鳌合物中配位体的发光：不少有机化合物虽然具有共轭双键，但由于不是刚性的分子不处于同一平面，因而不发荧光。若这些化合物和金属离子形成鳌合物，随着分子的刚性增加，平面结构增大，常常会发荧光。2020/4/5光学分析仪器培训28荧光分光光度法3、荧光分光光度法的特点3.3、荧光和分子的关系：（3）刚性结构和平面结构效应：一般来说，荧光物质的刚性和平面性增强，可使分子与溶剂或其它溶质分子的相互作用减小，既使外转移能量损失减小，从而有利于荧光的发射。如果分子内取代基之间形成氢键，加强了分子的刚性结构，其荧光强度将增加。2020/4/5光学分析仪器培训29荧光分光光度法3、荧光分光光度法的特点3.3、荧光和分子的关系：取代基的类型和位置：取代基对荧光体的影响分为加强荧光的、减弱荧光的和影响不明显的。加强荧光的取代基有—OH—ORR—NH2—CN、—NHR、—NR2、—OCH3等给电子取代基，由于它们n电子的电子云几乎与芳环上的π轨道平行，因而共享了功轭电子结构，同时，扩大了共轭双键体系。2020/4/5光学分析仪器培训30荧光分光光度法3、荧光分光光度法的特点3.3、荧光和分子的关系：减弱荧光的有—COOH、—NO2、—NO、—SH等得电子取代基，它们n电子的电子云并不与芳环上π电子平面。影响不明显的取代基有—NH3、—R、—SO3H等。（4）电子跃迁类型：含有氮、氧、硫杂原子的有机物，它们的荧光强度与电子跃迁类型有关。2020/4/5光学分析仪器培训31荧光分光光度法3、荧光分光光度法的特点3.3、荧光和分子的关系：3.3.2、金属鳌合物的荧光：除过元素的顺磁性原子会发生线状荧光光谱外，大多数无机盐类金属离子在溶液中只能发生无辐射跃迁，因而不产生荧光。但是,在某些条件下，金属鳌合物却能产生很强的荧光，并可用于痕量金属离子的测定。2020/4/5光学分析仪器培训32荧光分光光度法3、荧光分光光度法的特点3.3、荧光和分子的关系：（1）鳌合物中配位体的发光：不少有机化合物虽然具有共轭双键，但由于不是刚性的分子不处于同一平面，因而不发荧光。若这些化合物和金属离子形成鳌合物，随着分子的刚性增加，平面结构增大，常常会发荧光。2020/4/5光学分析仪器培训33荧光分光光度法3、荧光分光光度法的特点3.3、荧光和分子的关系：（2）鳌合物中金属离子的特征光谱：π这类发光过程通常是鳌合物首先通过配位体的π→π*跃迁而被激发，接着配位体把能量转移给金属离子，导致d→d*或f→f*路迁，最终发射的是d*→d或f*→f路迁光谱。2020/4/5光学分析仪器培训34荧光分光光度法4、荧光分析中常用参数4.1、激发光谱和发射光谱荧光的激发光谱和发射光谱是用荧光分析法进行定量和定性分析是的基本参数和依据。因次我们在学习荧光分光光度法时要对它加以了解。2020/4/5光学分析仪器培训35荧光分光光度法4、荧光分析中常用参数4.1.1、激发光谱:将样品放入光路中选择合适的发射单色器的波长和带宽并使之固定不变，让激发单色器的波长扫描，所得的图谱既为激发光谱。它反映了物质的荧光强度对激发波长的关系。2020/4/5光学分析仪器培训36荧光分光光度法4、荧光分析中常用参数4.1.1、激发光谱:Fλ激发2020/4/5光学分析仪器培训37荧光分光光度法4、荧光分析中常用参数4.1.1、激发光谱:它的特性：激发光谱从理论上讲同一物质的最大激发波长和最大吸收波长一致，但由于荧光测量仪器的特性如光源的分布、单色器的透射和检测器响应的影响，实际测量的荧光激发光谱与吸收光谱不完全一致。2020/4/5光学分析仪器培训38荧光分光光度法4、荧光分析中常用参数4.1.2、发射光谱（也叫荧光光谱）：将荧光样品放入光路中后，选择合适的激发单色器波长与带宽使之固定不变，让发射单色器的波长扫描图谱，所得光谱既为发射光谱。它反映了物质的荧光强度对发射波长的关系。2020/4/5光学分析仪器培训39荧光分光光度法4、荧光分析中常用参数4.1.2、发射光谱（也叫荧光光谱）：FΛ发射2020/4/5光学分析仪器培训40荧光分光光度法4、荧光分析中常用参数4.1.2、发射光谱（也叫荧光光谱）：荧光光谱通常具有如下特性；（1）斯托克斯位移；（2）荧光发射光谱的形状与激发光波长无关；（3）荧光光谱与吸收光谱的镜像关系。2020/4/5光学分析仪器培训41荧光分光光度法分子能级图：4、荧光分析中常用参数2020/4/5光学分析仪器培训42荧光分光光度法4、荧光分析中常用参数4.2荧光强度荧光强度是表示发射相对强度的物