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1胶体纳米颗粒用于生物传感器[摘要]本文回顾了纳米颗粒生物传感器的发展历程，表面化学及生物传感机理，讨论了如何使该种技术应用于商业和临床。在材料方面本文提出了包括纳米颗粒的大规模生产在内的五个关键挑战；为了更广泛的应用还需要仿生学，计算机模拟，生物信息学等方面的发展。[关键词]胶体纳米颗粒；生物传感器；量子点；贵金属纳米颗粒；1.引言胶体纳米颗粒作为生物传感器有很多优点，简要说来有以下几点：因为具有表面等离子体共振效应，胶体纳米颗粒的发光强度大；胶体纳米颗粒可以修饰其他基团作为分子标签；能够动态地与环境互动；使用胶体纳米颗粒作为生物传感器可以省去洗涤的步骤，因此有望做到实时监测；可以定性或定量检验目标分子。目前研究较多的胶体纳米颗粒有量子点和金纳米颗粒两种。量子点具有尺寸效应、粒径可调、单吸收、多发射、发射波长范围宽等特点，因此单一激发就能得到一系列发射波长不同、颜色各异的量子点荧光探针。此外，量子点还有光化学稳定性高、抗光漂白能力强、荧光不易淬灭等优良光学特性，因此成为生物学领域倍受关注的纳米荧光材料之一。在生物领域中，用作荧光标记探针是量子点最具发展前景的应用。在单颗粒水平下，量子点发出不连续的荧光，为了克服这个困难就要以核为中心，外围生长另一种材料的原子层，形成核壳结构的量子点。经过仔细设计包覆的量子点，其量子产率能达到90%[1,2]。图1.基于量子点和金纳米颗粒的生物传感器金纳米颗粒具有非常高的消光系数(如13nm金纳米颗粒的消光系数高达2.72×108mol/(L·cm),比一般的染料分子高1000倍以上，根据郎伯-比尔定律可知，金纳米颗粒所能达到的检测限远低于染料分子。由于金纳米颗粒体系在不同状态下会有不同的颜色变化，因此金纳米颗粒在可视化检测中占有重要的地位。金纳米颗粒的可视化检测机理是:单分散金纳米颗粒在溶液中呈现红色，当加入被检测物时，金纳米颗粒发生聚集，从而使颗粒间的等离子体耦合发生改变，吸收峰发生红移，溶液的颜色由红色变为紫色或蓝色。（见图1.）除了具有上述的光学特性外，金纳米颗粒表面易于进行化学修饰，这也为金纳米颗粒在分析检测中的广泛应用提供了便捷条件。金纳米颗粒表面可以通过修饰小分子、蛋白质、多肽等实现对不同靶标物质（包括小分子、重金属离子、蛋白质、核酸、肿瘤细胞和病原体等）的特异性检测。基于金纳米颗粒的可视化检测方法不依赖任何大型仪器，仅从溶液颜色变化即可作为读出信号，信号检出速度较快，所需材料成本较为低廉，尤其适用于有快速检测、现场检测需求和条件相对落后不具备大型仪器的区域[3]。常用的分析检验方法如酶联免疫吸附试验(ELISA)、聚合酶链式反应（PCR）、荧光原位杂交(FISH)等需要大量重复性劳动，同时因为有依赖于有机染料，不能进行持久的或多路复用的分析。改良以上方法有两条途径。一是纳米胶体颗粒用于微流控芯片取代酶联免疫吸附试验(ELISA)，二是在聚合酶链式反应（PCR）和荧光原位杂交(FISH)中以纳米胶体颗粒取代荧光染料或蛋白质，以此强化现有技术。纳米胶体颗粒在生物传感器方面的应用近年来得到了很大发展，但仍有许多障碍需要跨越，例如检测结果的可重复性、复杂生物环境下性能的优化、未纯化的液体如血液和尿液中与各种物质的相互作用。2.纳米颗粒的核2.1改进量子点传统量子点的组成如下：Ⅱ族-Ⅵ族，如BaS,BaSe,BaTe,ZnS,ZnSe,ZnTe,CdS,CdSe,CdTe。或Ⅲ族-Ⅴ族，如GaAs,InP,InAs。最常用的CdS,CdSe,CdTe有较大的生物毒性，为了取代这些重金属，人们开发了Si,C,Sn,合金及共轭聚合物的量子点。碳作为一切生物有机体的骨架元素，相对于其他元素构成的荧光纳米材料，3碳点的毒性低且具有良好的生物相容性，碳点表面含有大量功能基团，便于有机、无机高分子、聚合物以及生物活性物质的修饰。碳点在紫外区域光谱吸收较强，吸收峰可延伸至可见光区，如经微波/超声、电化学氧化、激光刻蚀等方法制备的碳点，其吸收峰在250-320nm之间，经修饰后波长会相应增加。例如：Liu等用甘油作为碳源，TTDDA作表面钝化剂，用微波法一步制备表面钝化的碳点。将其与人肝癌细胞系HepG-2共同培养，在450nm、488nm和543nm激发波长下分别发出蓝色、绿色和红色的明亮荧光[4]。以荧光共轭聚合物制备的纳米颗粒可以附着在蛋白质上而不产生毒性，这些有机半导体聚合物纳米球（SPNs）可用于对细菌进行、DNA检测、生物成像等方面。Philip等用溶剂蒸发法制备了PPE、MEH-PPV、BEHP-PPV和PF四种半导体聚合物纳米球。MEH-PPV半导体聚合物纳米球能很好的附着在活的海拉细胞（子宫颈癌传代细胞）表面[5]。2.2上转换发光材料光致发光材料中,先吸收长波然后辐射出短波的材料称为上转换材料,这种材料的上转换现象是反Stockes效应的,即辐射的能量大于所吸收的能量。上转换材料主要是掺稀土元素的固体化合物,利用稀土元素的亚稳态能级特性,可以吸收多个低能量的长波辐射,经多光子加和后发出高能的短波辐射,从而可使人眼看不见的红外光变为可见光。上转换发光材料在肿瘤的多模式影像诊断和高效治疗中的应用基础研究倍受关注，因其用于激发的近红外光源具有较大的光穿透深度，无生物组织自荧光，对生物组织几乎无损伤。[6,7]关于上转换发光材料，目前的着眼点是提高发光亮度和改进表面化学。2.3贵金属纳米颗粒贵金属的形状和大小不同造成发光现象不同，例如小于2nm的贵金属（Au、Ag、Pt）颗粒的在紫外、可见、近红外都存在荧光带。与量子点相比，贵金属纳米颗粒的生物相容性好，荧光强度大，光稳定性好，发光寿命长。因为贵金属纳米颗粒的尺寸小，低于5.5nm的肾清除限制，这一特性可能用于严重代谢疾病的实时监测。当贵金属纳米颗粒的直径高于2nm时，存在局域表面等离子体共振现象(LSPR：mcalizedSurfacePlasmonResonance)。简单来讲，当光线入射到由贵4金属构成的纳米颗粒上时，如果入射光子频率与贵金属纳米颗粒或金属岛传导电子的整体振动频率相匹配时，纳米颗粒或金属岛会对光子能量产生很强的吸收作用，就会发生局域表面等离子体共振。金、银、铂等贵金属纳米粒子在紫外可见光波段展现出很强的光谱吸收，从而可以获得局域表面等离子体共振光谱。该吸收光谱峰值处的吸收波长取决于该材料的微观结构特性，例如组成、形状、结构、尺寸、局域传导率。因此，获得局域表面等离子体共振光谱,并对其进行分析，就可以研究纳米粒子的微观组成。同时，LSPR吸收谱还对周围介质极其敏感，因此可以作为基于光学信号的化学传感器和生物传感器。贵金属纳米颗粒的研究焦点集中于新的合成路线和通过改变纳米颗粒的大小调整发射峰位置这两个方面。2.4纳米颗粒的制备纳米颗粒的性质受合成路径的影响，因为其性质对大小、形状、晶体结构及缺陷、掺杂、表面形貌和电荷、稳定剂的浓度等因素均十分敏感，此性质有利于调控的同时也造成了重现性差。合成纳米颗粒最常用的方法是溶液合成法，既由前体中的配体形成高质量的纳米晶，可以对形状、大小进行调控。关键点是：搅拌速度、容器形态、前体注入的位置。有望解决批次与批次之间性能差别的问题的途径有微管连续流系统、实时监测技术、微流体合成平台等。2.4.1微反应器连续流系统传统合反应在烧瓶等容器中进行,这种间歇式操作方法不但存在受热不均匀、反应时间长、合成效率低等缺点，而且放大合成需要经过复杂的中试和工艺参数的优化。而微反应器在连续生产、温度控制、放大合成以及安全性能等方面明显优越于常规反应器,近年来，微管连续流反应器已经越来越广泛地用于有机和医药中间体的合成、精细化学品生产、催化剂性能测试以及反应机理研究中。利用微管连续流反应器能高效、规模化合成纳米颗粒[8]。Emory等[9]用高通量批量反应阵列合成平均粒径变差系数为0.2%的CdSe胶体纳米颗粒，利用衍射和光学表征将多维参数空间映射到调节CdSe胶体纳米5颗粒尺寸与分散性的方法上，实现其发光效率最大化。并将这方法运用于制备稀土掺杂的NaYF4晶体，控制其晶相，使其上转换荧光最大化。实验装置是基于Symyx公司（赛美公司）的核心技术模块的自动化纳米材料制备与分析工作站（WANDA），该工作站已自动控制液体的机器人技术模仿传统的合成方法，例如等分采样和将有机金属试剂注射入热的表面活性剂溶液中等操作。（见图2.）工作站包括分配表面活性剂用的热针、操纵固态物质的夹钳、记录样品质量的电子天平以及自制的具有数字调谐的磁力搅拌加热装置的低热量传质反应器，反应溶液盛装在独立的40mL玻璃罐中以避免交叉污染。WANDA具有灵活性，可以制备球形、棒状、纳米线等形态的半导体、金属、氧化物、掺杂的纳米颗粒，用户友好的大通量的WANDA将有利于制备质量稳定的纳米材料，促进纳米材料投入应用。图2.自动化纳米材料制备与分析工作站（WANDA）2.4.2实时监测技术化学合成成分实时监测方法是一种新型化学过程分析技术,而传统实时监测技术主要是对反应过程中的某些宏观指标如温度、压力和流量等参数进行监控。实时监测技术是采用能对化学过程的宏观参数和/或微观变量进行实时动态监测的分析方法和通讯系统,以保证对化学反应实施有效的监控和调整。实时监测技术有以下优点：它能对反应进程和终点进行合理调控与确认,从而有效提高反应的选择性、反应物的转化率、产物的质量和收率,降低副反应和生成副产物的可能性,以达到定量合成目标产物的目的。利用它还可以从微观上探索发生化学反应的机理和动力学。实时监测化学合成成分装置的基本结构包括:化学反应系统;电源系统、激发6(光)源与辅助设备(如真空和温度控制装置);采样器(或传感器);样品室(池);分离分析系统(检测器);信号采集与加工处理(转换)系统;结果记录与显示系统;中央控制(计算机)与数据传输系统等。实时监测化学合成成分装置的工作原理概括为以下几步：（1）在一个化学反应系统中,检测单元通过对化学反应系统物质间相互作用所产生信息的实时采集和检测,（2）通过输入/输出单元,将待测物质的理化特征参数等非电物理量输出信号模拟转换成电信号传输到计算机,将模拟信号转换成数字信号,（3）和预先设置的参比值进行对比和判断,以确定待测物质的组成、浓度、含量、纯度或揭示物质结构的动态变化规律,从而实现对特定化学成分的自动跟踪和控制。实现对化学合成成分的实时监控需要解决以下问题：首先是对反应物、中间体或产物本身的研究；其次还必须解决样品的采集、进样以及单元仪器间的各种接口问题,特别是在色谱-光谱联用系统中更是如此;还有样品或反应液对采样器或检测窗口的污染问题;同时,对输入/输出的信号进行高速数据处理和传输也是十分关键的问题。目前,在化学合成成分的实时监测中使用最普遍的是光谱法、色谱法以及色谱-光谱联用技术等。[10]2.4.3微流体合成平台微反应器(microreactor)一般是指通过微加工和精密加工技术制造的小型反应系统,微反应器内微通道尺寸在毫米量级以下,一般在10～300μm，利用微反应器进行的化学合成我们称之为微流控合成。通过微流控技术实现的微混合过程体现出如下的优点：减小试剂用量，更加优良的热和物质传导交换，能够有效实现对空气和湿度敏感的化学反应，较安全地合成危险化合物。这些优点也激发了微纳米粒子合成界的浓厚兴趣，已经有许多微纳米粒子的合成工作在微混合过程的基础上展开。例如，已经发现，在微混合器中，反应物在低雷诺数下的连续流中混合，反应驻留时间、温度、试剂浓度的变化都能影响粒子的平均大小，减小驻留时间和精确控制化学反应状态可减小径粒的分布；对于不同物质之间的化学反应与粒子形成过程，微通道的较大比表面积能够更有效地控制生成粒子的形状、晶体结构，也可在多通道流操纵下对形成粒子做出进一步的表面修饰。因此，以更精确的微流控方式调节混合/合成反应参数，可以制备出不同形状、粒径以及粒径分布的微纳米粒子甚至各向异性的7纳米材料。[11,12,13]图3.微流控芯片制有机纳米颗粒如图3.所示,以迅速的混合生成有机物纳米