高效液相色谱柱发展史

第三节高效液相色谱(highperformanceliquidchromatograpphy,HPLC)液相色谱基础1．色谱图和峰参数★色谱图(chromatogram)--样品流经色谱柱和检测器，所得到的信号-时间曲线，又称色谱流出曲线(elutionprofile)。★基线(baseline)--经流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。一般应平行于时间轴。★噪音(noise)--基线信号的波动。通常因电源接触不良或瞬时过载、检测器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。★漂移(drift)--基线随时间的缓缓变化。主要由于操作条件如电压、温度、流动相及流量的不稳定所引起，柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移。★色谱峰(peak)--组分流经检测器时响应的连续信号产生的曲线。流出曲线上的突起部分。正常色谱峰近似于对称形正态分布曲线（高斯Gauss曲线）不对称色谱峰有两种：前延峰(leadingpeak)和拖尾峰(tailingpeak)。前者少见。色谱图★拖尾因子(tailingfactor，T)，用以衡量色谱峰的对称性。也称为对称因子(symmetryfactor)或不对称因子(asymmetryfactor)。《中国药典》规定T应为0.95～1.05。T＜0.95为前延峰，T＞1.05为拖尾峰。★峰底-基线上峰的起点至终点的距离。★峰高(peakheight，h)-峰的最高点至峰底的距离。★峰宽（peakwidth，W)-峰两侧拐点处所作两条切线与基线的两个交点间的距离。W＝4σ★半峰宽（peakwidthathalf-height，Wh/2)-峰高一半处的峰宽。Wh/2＝2.355σ★标准偏差（standarddeviation，σ)-正态分布曲线x＝±1时（拐点）的峰宽之半。正常峰的拐点在峰高的0.607倍处。标准偏差的大小说明组分在流出色谱柱过程中的分散程度。σ小，分散程度小、极点浓度高、峰形瘦、柱效高；反之，σ大，峰形胖、柱效低。★峰面积(peakarea，A)-峰与峰底所包围的面积。2．定性参数（保留值）★死时间(deadtime，t0)--不保留组分的保留时间。即流动相（溶剂）通过色谱柱的时间。在反相HPLC中可用苯磺酸钠来测定死时间。★死体积(deadvolume，V0)--由进样器进样口到检测器流动池未被固定相所占据的空间。它包括4部分：进样器至色谱柱管路体积、柱内固定相颗粒间隙（被流动相占据，Vm）、柱出口管路体积、检测器流动池体积。其中只有Vm参与色谱平衡过程，其它3部分只起峰扩展作用。为防止峰扩展，这3部分体积应尽量减小。V0＝F×t0（F为流速）★保留时间(retentiontime，tR)--从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大值的时间。★保留体积(retentionvolume，VR)--从进样开始到某组分在柱后出现浓度极大值时流出溶剂的体积。又称洗脱体积。VR＝F×tR3．柱效参数★理论塔板数(theoreticalplatenumber，N)---用于定量表示色谱柱的分离效率（简称柱效）。N取决于固定相的种类、性质（粒度、粒径分布等）、填充状况、柱长、流动相的种类和流速及测定柱效所用物质的性质。在一张多组分色谱图上，如果各组分含量相当，则后洗脱的峰比前面的峰要逐渐加宽，峰高则逐渐降低。用半峰宽计算理论塔数比用峰宽计算更为方便和常用，因为半峰宽更易准确测定，尤其是对稍有拖尾的峰。N与柱长成正比，柱越长，N越大。用N表示柱效时应注明柱长，如果未注明，则表示柱长为1米时的理论塔板数。（一般HPLC柱的N在1000以上。）若用调整保留时间(t‘R)计算理论塔板数，所得值称为有效理论塔板数(N有效)。★理论塔板高度(theoreticalplateheight，H)---每单位柱长的方差。实际应用时往往用柱长L和理论塔板数计算。4．相平衡参数★分配系数(distributioncoefficient，K)--在一定温度下，化合物在两相间达到分配平衡时，在固定相与流动相中的浓度之比。分配系数与组分、流动相和固定相的热力学性质有关，也与温度、压力有关。在不同的色谱分离机制中，K有不同的概念：吸附色谱法为吸附系数，离子交换色谱法为选择性系数(或称交换系数)，凝胶色谱法为渗透参数。但一般情况可用分配系数来表示。在条件(流动相、固定相、温度和压力等)一定，样品浓度很低时，K只取决于组分的性质，而与浓度无关。这只是理想状态下的色谱条件，在这种条件下，得到的色谱峰为正常峰；在许多情况下，随着浓度的增大，K减小，这时色谱峰为拖尾峰；而有时随着溶质浓度增大，K也增大，这时色谱峰为前延峰。因此，只有尽可能减少进样量，使组分在柱内浓度降低，K恒定时，才能获得正常峰。在同一色谱条件下，样品中K值大的组分在固定相中滞留时间长，后流出色谱柱；K值小的组分则滞留时间短，先流出色谱柱。混合物中各组分的分配系数相差越大，越容易分离，因此混合物中各组分的分配系数不同是色谱分离的前提。在HPLC中，固定相确定后，K主要受流动相的性质影响。实践中主要靠调整流动相的组成配比及pH值，以获得组分间的分配系数差异及适宜的保留时间，达到分离的目的。★容量因子(capacityfactor，k)--化合物在两相间达到分配平衡时，在固定相与流动相中的量之比。因此容量因子也称质量分配系数。容量因子的物理意义：表示一个组分在固定相中停留的时间（t‘R）是不保留组分保留时间（t0）的几倍。k＝0时，化合物全部存在于流动相中，在固定相中不保留，t‘R＝0；k越大，说明固定相对此组分的容量越大，出柱慢，保留时间越长。容量因子与分配系数的不同点是：K取决于组分、流动相、固定相的性质及温度，而与体积Vs、Vm无关；k除了与性质及温度有关外，还与Vs、Vm有关。由于t‘R、t0较Vs、Vm易于测定，所以容量因子比分配系数应用更广泛。★选择性因子(selectivityfactor，α)--相邻两组分的分配系数或容量因子之比。α又称为相对保留时间（《美国药典》）。要使两组分得到分离，必须使α≠1。α与化合物在固定相和流动相中的分配性质、柱温有关，与柱尺寸、流速、填充情况无关。从本质上来说，α的大小表示两组分在两相间的平衡分配热力学性质的差异，即分子间相互作用力的差异。5．分离参数★分离度(resolution，R)--相邻两峰的保留时间之差与平均峰宽的比值。也叫分辨率，表示相邻两峰的分离程度。当W1＝W2时，R＝1。当R＝1时，称为4σ分离，两峰基本分离，裸露峰面积为95.4%，内侧峰基重叠约2%。R＝1.5时，称为6σ分离，裸露峰面积为99.7%。R≥1.5称为完全分离。中国药典规定R应大于1.5。提高分离度有三种途径：①增加塔板数。方法之一是增加柱长，但这样会延长保留时间、增加柱压。更好的方法是降低塔板高度，提高柱效。②增加选择性。当α＝1时，R＝0，无论柱效有多高，组分也不可能分离。一般可以采取以下措施来改变选择性：a.改变流动相的组成及pH值；b.改变柱温；c.改变固定相。③改变容量因子。这常常是提高分离度的最容易方法，可以通过调节流动相的组成来实现。k趋于0时，R也趋于0；k增大，R也增大。但k不能太大，否则不但分离时间延长，而且峰形变宽，会影响分离度和检测灵敏度。一般k在1～10范围内，最好为2～5，窄径柱可更小些。HPLC组成示例17一、液相色谱分离的基本原理液相色谱方法的分类液相色谱分离方法大致可以分为正相色谱、反相色谱、离子交换色谱、疏水作用色谱、体积排除色谱、亲和色谱以及手性色谱。在高效液相色谱法中，目前应用得最广泛的是正相色谱和反相色谱，其中反相色谱又是重中之中。液相色谱分离原理正相色谱的分离原理：根据溶质极性的不同而产生的溶质在吸附剂上吸附性强弱的差异而分离。反相色谱的分离原理：根据因溶质疏水性的不同而产生的溶质在流动相与固定相之间分配系数的差异而分离。高效液相色谱法是采用高效填充剂，利用高压输液泵将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有填充剂（固定相）的色谱柱进行分离测定的色谱方法。经由进样阀注入的供试品，有流动相带入柱内，各成分在柱内被分离后，依次进入检测器，有记录仪、积分仪或数据处理系统记录色谱信号。二、高效液相色谱仪的分析原理1.流程2.主要部件(1)高压输液泵主要部件之一，压力：150～350×105Pa。为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（10μm），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性(2)进样装置流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置，其结构如图所示：(3)高效分离柱柱体为直型不锈钢管，内径1～6mm，柱长5～40cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。3.5高效液相色谱的检测器紫外检测器：荧光检测器：蒸发光散射检测器：示差折光检测器：质谱检测器：3.5.1紫外-可见检测器可分为三种类型：固定波长型、可变波长型及二极管阵检测器。应用最广，对大部分有机化合物有响应。特点：灵敏度高；线形范围高；流通池可做的很小（1mm×10mm，容积8μL）；对流动相的流速和温度变化不敏感；波长可选，易于操作；可用于梯度洗脱。二极管阵列检测器工作原理为：当复光透过流通池后，被组分选择性吸收，透过光具有了组分的光谱特征。此透过光（复光）被光栅分光后，形成组分的吸收光谱，照射到光电二极管阵列装置上，使每个纳米光波的光强变成相应的电信号强度。这种记录方式不需扫描，因此最短能在几个毫秒的瞬间内获得流通池中色谱组分的吸收光谱。光源检测室光栅二极管阵列检测UVdetectorcell内容积：1-10l光路长：2-10mm3.5.2荧光检测器荧光检测器是一种很灵敏的,有选择性的检测器,其灵敏度比UV高10~1000倍,。它用于检测物质本身具有荧光或为了提高灵敏度将无荧光的物质衍生成荧光体。可用荧光检测的物质：氨基酸、多糖、维生素等。紫外检测：UV的测定灵敏度可达10-12mol/L荧光检测：检测范围在10-12~10-15mol/L衍生方式：1）柱前衍生：2）柱后衍生：灵敏度高选择性好共轭双键刚性、平面性荧光衍生荧光探针荧光检测器结构示意图3.5.3示差折射检测器通过连续监测参比池和测量池中溶液的折射率之差来测定溶质浓度。由于折射率是物质的通用性质，示差折射检测器是一种通用型的整体性质检测器原则上凡是与流动相光折射率有差别的样品都可用它来测定，其检测限可达（10-6~10-7）g/mL。由于折射率对温度的变化非常灵敏，大多数溶剂折射率的温度系数约为5×10-4，因此，检测器必须恒温，才能获得精确的结果。折射检测器的灵敏度较低，不能用于梯度洗脱。3.5.4蒸发光散射质量检测器（EvaportivelightScatteringDetector,ELSD)ELSD的通用检测方法消除了常见于传统HPLC检测方法中的难点，不同于紫外和荧光检测器，ELSD的响应不依赖与样品的光学特性，ELSD的响应值与样品的质量成正比，任何挥发性低于流动相的样品均能被检测，不受其官能团的影响。示差检测器（RI）也可以说是一种通用型检测器，它灵敏度低，并与梯度脱洗不相容。质谱是另一种通用型检测器，但它的昂贵操作费用和复杂性限制了它的应用。在一定的条件下，光散射强度正比于溶质粒子的大小和数量。散射光强度与样品微粒质量的关系为I=kmb式中，m为微粒质量，k、b为实验条件（如温度、流动相性质）决定的常数。因此可根据散射光强度对样品进行定量分析。工作原理：（1）用惰性气体雾化脱洗液（2）蒸发光散射检测器流动相在加热管（漂移管）中蒸发（3）样品颗粒散射光后得到检测ELSD检测分为三个步骤：1)可检测挥发性低于流动相的任何样品；2)流动相低温雾化和蒸发，对热不稳定和挥发性化合物亦有较高灵敏度；3)广泛的梯度和溶剂兼容性，无溶剂峰干扰；4)辅助载气提高了检测灵敏度，