clampfit

一、I-V曲线的制作1、clampfit的快速作图适用于全细胞记录电流、当Waveform中的电压为步阶（step）变化时，可制作出标准I-V曲线。具体做法：参照pclamp8.0说明书p149页（包括目录实际p165）。《实用膜片钳技术》（刘振伟主编）中见p325页。①、打开要分析的图形文件（例如cav1.abf）。在分析之前先要了解protocol。通过点击View/ViewStimulusWaveform，可了解刺激波型；而通过点击File/Properties即可看到protocol的全部参数。包括run数（=1）、sweep数（=7）、Epoch设置、采样间隔（Samplinginterval，=500）等。这里我们主要是了解每个Epoch（A、B、C）的时间（firstduration，=50，450）：实际时间=Epoch的采样点数×采样间隔÷1000，单位为ms。在例子cav1.abf中，EpochA、B的时间为25、225ms。由于实际记录时，在执行EpochA之前和B之后都留置一定采样时间（=3ms），故而实际能用于I-V曲线分析的图形时间是从起点开始计算，在执行EpochB时的时间段内，大致在（28-253）ms。②、设定所要分析的区间范围。这一区间范围应该在执行EpochB时的时间段内（28-253）ms，不能超出。而且，这个时间段要能将各个sweep的峰值都包括在内。分析时，主要是分析游标（Cursor）1和游标2之间的曲线。为此，本例中，我们首先在游标（Cursor）1的数据框处双击，打开游标（Cursor）1特性对话框（CursorPropertiesforCursor1），在Moveto/Time处，修改时间为32。点击Next，进入游标2特性对话框，同样在Moveto/Time处，修改时间为250，并取消对话框右下Acquisition旁delta和datavalve旁delta的钩选。③、点击Analyze/QuickGraph/I-V，开启I-V对话框。④、X轴设定：I-V曲线的X轴为电压（mV）。有两种途径来设置X轴电压：以游标1或3的位置来定义；或者以Epoch来定义。本例子中，由于所有4个游标都设置在EpochB范围内。因此，在X轴的Waveform中，这三个选择的结果应该是一样的。不必修改。⑤、Y轴设定：我们将以步阶电压引出的外向（outward）锋电流来打点划线。为了避免电容电流的影响，我们这里限定分析范围是游标1和游标2间（Cursor1..2）的正向（positive）锋电流（Peak）。为了减少高频噪声或个别通道开放的影响，可以钩选SmoothingPoints项。本例中，我们设定SmoothingPoints的值是11。⑥、最后，点击OK即可出现I-V曲线。在做好的曲线图内，双击即可出现GraphWindowProperties对话框，在此对话框中，可对I-V曲线的显示作适当的调整。二、曲线拟合（fitting）的一般步骤参照《实用膜片钳技术》（刘振伟主编）中p339页。以指数方程（Exponential,standard）对钠离子通道的衰减过程进行拟合为例。①、打开pClamp9.0/data/中的sodiu01.abf文件，选择Sweep号码（以第11条为例），用游标1与游标2选择欲拟合的区域。选择Sweep的方法即是：点击View/SelectSweeps，或是在右击鼠标后的菜单中选择SelectSweeps，出现SelectSweeps对话框，在其中点选Sweep＃11，点击OK键即可。如要选择多个Sweep，则需要在按住shift或ctrl键同时点选多个Sweep。或点击SelectOdd来点选奇数Sweep，点击SelectEven来点选偶数Sweep。②、打开Analyze/Fit。在打开的Fit对话框中：（a）、从Function/method设定框下的PredefinedFunction中点选“Exponential,standard”方程，在Numberofterms中输入6，让程序自动选择拟合方法。（b）、在Data/Options设定框下选择Comparemodels和Automatic。让程序自动比较各种拟合方法的统计学差异。（c）SeedValues设定框下不作任何设定。要对某条Sweep或某几条Sweep进行拟合时，实际上光用第①步方法选择并无作用。还应在Analyze/Fit/（Data/Options）/TraceSelection中选择好欲拟合的Sweep号码。③、点击OK键。即可看到拟合曲线。若想看到拟合曲线的各个部分以及残差（Minimax）大小，可打开View/FitDisplay对话框，选择Components和Residuals。④、打开Analyze/FittingResults窗口，查看拟合结果。Parameters框显示出拟合参数，框显示出拟合的统计结果。结果显示该钠通道的衰减过程用三指数方程拟合最佳，3个时间常数τ值是从拟合曲线的右侧向左侧算起。不过，当游标1与游标2的位置改变时，所拟合的结果不一样。这样看来，这种拟合没有意义似的？？？？？？？？