细胞电生理学与膜片钳技术2

2、膜片钳技术及其应用3、膜片钳系统装置1、细胞电生理学OUTLINE小林/forry祝你科研学习顺利膜片钳实验室基本设备•膜片钳放大器•信号转换器•倒置显微镜•微操纵器•防震工作台及静电屏蔽笼•微电极拉制仪及抛光仪•计算机•专用软件•细胞记录槽•恒速灌流泵Electrophysiology-ApparatusFaradaycageVibrationIsolationTableMicroscopeMicro-ManipulatorsRemoteControllerAmplifiersCCDCameraElectrophysiology-ApparatusMicro-ManipulatorsDAD-VCsystemCCDCameraElectrophysiology-ApparatusElectrophysiology-ApparatusPatchclampAutomaticPatchClampRobot原理：硅硼玻璃制造的芯片对悬浮细胞进行钳制。芯片上有约1µm的孔，从芯片内侧用泵施以负压使悬浮细胞被吸引到开孔处而形成封接。膜片钳记录的基本步骤可概括为4大部分：1.液体配制。主要根据研究通道的不同，配制相应的液体，基本原则是保持2个平衡：渗透压平衡和酸碱平衡。2.标本的制备。膜片钳记录标本的制备主要有：急性分离、细胞培养、脑片或其它组织薄片。当根据不同的研究要求而相应选择。3.膜片钳记录4.资料分析用相应的计算机软件进行3.膜片钳记录•电极拉制：一般采用常规二步法完成，电极尖端直径在0.5-2.0μm之间，是否涂胶与抛光应根据经验而定，不必强求。•亿欧姆封接：电极充灌安装后即给持续正压，在倒置显微镜监视下将电极贴近细胞，以微操纵器将电极贴于细胞，去掉正压后再稍施负压吸引，亿欧姆封接便瞬间形成。要保证亿欧姆封接就必须做到：1)电极电阻适当；2)电极尖端清洁；3)电极气路通畅；4)电极与细胞相贴宁不及而勿过之；5)细胞膜清洁，活性好。4.资料分析•一般电学性质：通过I/V关系计算单通道电导，观察通道有无整流。通过离子选择性、翻转电位或其它通道激活条件初步确定通道类型。•通道动力学分析：开放时间、开放概率、关闭时间、通道的时间依赖性失活、开放与关闭类型(簇状猝发，Burst)样开放与闪动样短暂关闭(flickering)，化学门控性通道的开、关速率常数等。•药理学研究：研究的药物，阻断剂、激动剂或其它调制因素对通道活动的影响情况。•综合分析得出最后结沦．膜片钳在药理学研究中的应用膜片钳技术不仅对于细胞生物学领域的发展以及对于阐明各种疾病的机制具有革命性意义，而且开辟了一条探索药物作用机制和发展新的更为有效药物的途径。正如诺贝尔基金会在颁奖时所说:“Neher和Sadmann的贡献有利于了解不同疾病机理,为研制新的更为特效的药物开辟了道路”。膜片钳技术的一大优点就是在通道电流记录中,可分别于不同时间、不同部位(膜内或膜外)施加各种浓度的药物或毒素,研究它们对通道功能的可能影响。通过研究,一方面可深入了解哪些选择性作用于通道的药物和毒素影响人和动物生理功能的分子机理;另一方面,分析各种药物对通道蛋白的选择性相互作用的特点,提供有关通道蛋白亚单位结构与功能关系的信息。药物作用机制研究•膜片钳技术对离子通道的动力学研究以及药物与通道相互作用机制的研究。•药物对通道电压依赖的激活和灭活过程的影响•药物对离子通道状态依赖性的作用（如大多数Ⅰ类抗心律失常药与失活状态的Na+通道结合而发挥作用）。•药物的频率依赖性（frequency-dependent）或使用依赖性（use-dependent）（如维拉帕米）以及药物对离子通道亚型的选择性作用等。•膜片钳技术还在作用于通道活性受体和第二信使调节的药物的机制研究中发挥了重要作用。如证明了肾上腺素能介质及药物激活β受体后，通过第二信使cAMP激活蛋白激酶A，使钙通道磷酸化，由关闭状态转为开放。新药开发在现代药物研究中，新靶点的建立往往是新药创制的前提。随着膜片钳技术运用对许多新受体亚型的发现和特性研究，新型受体阻断剂将在选择性、高效性上发挥更大的作用。•近十年来药物学研究最重要的成就之一就是首先合成了各类钙拮抗剂(如硝苯砒啶、硫氮卓酮和维拉帕米及其衍生物)。•研制出钾通道开放剂（nicorandil、pinacidil等）•Ⅲ类抗心律失常新药是近年来心血管药理的重要研究方向。•离子通道病及与离子通道调节缺陷有关疾病的研究。•将基因工程与膜片钳技术结合起来,把通道蛋白有目的地重组于人工膜中进行研究。设想将合成的通道蛋白分子接种入机体以替换有缺陷和异常的通道的功能而达到治疗的目的。离子通道药理学离子通道药理学Patch-clamp技术新药开发Na+,Ca2+,K+,Cl-等电流分子生物学技术单细胞电流记录离子通道的结构与功能药物作用机制基因克隆及蛋白表达通道蛋白功能测定一、离子选择性(selectivity)（大小和电荷）：某一种离子只能通过与其相应的通道跨膜扩散(安静：KNa100倍、兴奋：NaK10-20倍）；各离子通道在不同状态下，对相应离子的通透性不同。二、门控特性(Gating)：失活状态不仅是通道处于关闭状态，而且只有在经过一个额外刺激使通道从失活关闭状态进入静息关闭状态后，通道才能再度接受外界刺激而激活开放。开放状态openstate失活状态Inactivestate静息状态restingstate激活activation失活inactivation复活recovery二、离子通道的特性(CharacteristicofIonChannels)(参见P27图24-1)三、离子通道的功能(FunctionofIonChannels)1.产生细胞生物电现象,与细胞兴奋性相关。2.神经递质的释放、腺体的分泌、肌肉的运动、学习和记忆3.维持细胞正常形态和功能完整性膜离子通道的基因变异及功能障碍与许多疾病有关，某些先天性与后天获得性疾病是离子通道基因缺陷与功能改变的结果，称为离子通道病(ionchannelpathies)。四、Classificationofionchannels（一）、非门控离子通道（背景或漏通道）：始终处于开放状态，离子可随时进出细胞，并不受外界信号的明显影响，如产生静息电位的K+通道。（二）、门控离子通道：①电压门控（Voltagegatedchannels)离子通道：受膜电位的变化影响，如决定细胞兴奋性、不应期和传导性的K+通道、Na+通道、Ca2+通道。②配体门控（Ligandgatedchannels)离子通道：由递质与通道蛋白分子上结合位点相结合开启，如乙酰胆碱激活钾通道等。③机械门控离子通道(Mechanicallygatedionchannels)：由机械牵拉激活，如内耳毛细胞顶端机械门控通道。电压门控离子通道的分子结构示意图亚基(,,等）α亚基的四个跨膜区（D1-D4）S1S2S3S5S6S4电压感受器（voltagesensor）孔道区（poreregion）6个呈α螺旋式的跨膜片断（transmembranesegments,S1-S6）离子通道的晶体结构与模型钾离子孔道螺旋选择性过滤器NC（一）电压门控离子通道的分类钠通道神经类钠通道骨骼肌类钠通道心肌类钠通道(持久、瞬时)钙通道L-型（心肌窦房结、房室结）；T-型（心脏传导组织）；N-型（中枢神经系统神经元和突触部位）；P-型（大脑）；Q-型（小脑、海马、脊髓）；R-型（神经细胞）钾通道瞬时外向钾通道(Ito)延迟整流钾通道(IK)内向整流钾通道(IK1)起搏电流(If)快反应细胞APandIonchannels01234INaICaIKrIKsIK1IK1IToINa-CaIto1Ito21.电压门控钠通道选择性允许Na+跨膜通过。维持细胞膜兴奋性及其传导（AP的0相）。存在于心房、心室肌细胞和希普系统。特征电压依赖性：去极化激活，产生内向钠电流（INa）快速激活（1ms）和快速失活（10ms）有特异性激活剂（BTX、GTX）和阻滞剂（TTX、STX、μCTX）电压门控钠通道分类神经类钠通道（对TTX敏感性高、对μCTX敏感性低）骨骼肌类钠通道（对TTX和μCTX敏感性均高）心肌类钠通道（对TTX和μCTX敏感性均低），又分为持久（慢）钠通道和瞬时（快）钠通道。持久钠通道瞬时钠通道激活电压较低、失活速度慢激活电压较高、失活速度快维持动作电位2相平台期引起动作电位0相去极化对低浓度TTX等敏感对高浓度TTX等敏感2.电压门控钙通道钙通道存在于机体各种组织细胞，在正常情况下为细胞外Ca2+内流的离子通道（AP平台期），是调节细胞内Ca2+浓度（[Ca2+]i）的主要途径。特征:电压依赖性：去极化激活缓慢激活（20-30ms）和缓慢失活（100-300ms）：在心肌细胞上，当钙通道尚未激活时，钠通道已经失活。对离子的选择性较低：在细胞外Ca2+浓度（[Ca2+]o）下降时，也允许Na+通过。电压门控钙通道目前已克隆出L、T、N、P、Q和R6种亚型的电压依赖性钙通道，心血管系统主要有L-型和T-型。L-型钙通道（Long-lasting)T-型钙通道(Transient)激活电压高、缓慢失活激活电压低、迅速失活分布于各种可兴奋细胞多见于心脏传导组织心脏兴奋-收缩偶联血管舒缩心脏的自律性血管张力3.电压门控钾通道选择性允许K+跨膜通过的离子通道(参于RP、心率、APD调节）。是目前发现的亚型最多、作用最复杂的一类离子通道。1.瞬时外向钾通道电流（Ito）：Ito1（不依赖于细胞内钙浓度，对4-AP敏感）是复极1期的主要参与电流。Ito2（依赖于细胞内钙浓度，对4-AP不敏感）可能是减少钙超载的一种负反馈机制（缩短动作电位时程）。2.延迟整流钾通道电流（IK）：缓慢成分（IKs）和快速成分（IKr）是AP2、3相的主要复极电流。Ⅲ类抗心律失常药物选择性阻滞IKr，使动作电位时程延长。超快速成分（IKur）对心房肌复极重要，与房性心律失常有关。3.内向整流钾通道电流（IK1）：IK1主要参与AP3相复极晚期及4相RP的维持。4.起搏电流（If）：If由K+和Na+共同携带的离子电流。肾上腺素使If电流增加，交感神经刺激加快心率,乙酰胆碱可抑制If，迷走神经减慢心率。电压门控钾通道（二）配体门控离子通道当配体与配体门控离子通道结合后，引起通道蛋白构型变化，致通道开放。心血管系统主要有:1.乙酰胆碱激活钾通道(KACh)：参与迷走调控。2.ATP敏感钾通道(KATP)：心肌缺血、缺氧开放。3.钙激活钾通道(KCa)：参与血管张力调控。KAChKCaKATPACh作用于M受体去极化、[Ca2+]i↑细胞内ATP/ADP↓增加舒张电位复极化或超极化缩短动作电位时程负性频率作用调节肌源性张力Ca2+内流减少配体门控离子通道Classificationofionchannels(离子通道的分类)（一）、非门控离子通道（背景或漏通道）：始终处于开放状态，离子可随时进出细胞，并不受外界信号的明显影响，如产生静息电位的K+通道。（二）、门控离子通道：①电压门控（Voltagegatedchannels)离子通道：受膜电位的变化影响，如决定细胞兴奋性、不应期和传导性的K+通道、Na+通道、Ca2+通道。②配体门控（Ligandgatedchannels)离子通道：由递质与通道蛋白分子上结合位点相结合开启，如乙酰胆碱激活钾通道等。③机械门控离子通道(Mechanicallygatedionchannels)：由机械牵拉激活，如内耳毛细胞顶端机械门控通道。第二节作用于心血管系统离子通道的药物Drugsusedincardiovascularionchannels作用于钠通道的药物作用于钾通道的药物作用于钙通道的药物一、作用于钠通道的药物Thedrugsusedinsodiumchannel作用于钠通道的药物主要是钠通道阻滞药，临床常用的有局部麻醉药、抗癫痫药和Ⅰ类抗心律失常药。二、作用于钾通道的