第十章-RNA加工与核糖核蛋白复合体

第十章RNA加工与核糖核蛋白复合体一、rRNA加工与核糖体1.RNA的加工类型•成熟的RNA分子很少是转录形成的•大多数新生RNA分子经历多种修饰才成为成熟的产物•RNA加工是对初生转录物进行修饰的总称，常见的加工类型包括：A.内切核酸酶和外切酶对核苷酸的切除B.向初生RNA转录物或剪切产物的3’端和5’端添加核苷酸C.向某些特殊的核苷酸碱基或糖苷进行修饰primarytranscriptmatureRNA.NucleusorNucleolusCytoplasmRNAprocessingRomovalofnucleotidesadditionofnucleotidestothe5’-or3’-endsmodificationofcertainnucleotides2.原核生物的rRNA加工•在E.coli中，有7种不同的rRNA操纵子分散在基因组中•每一个操纵子都包含5SrRNA、16SrRNA、23SrRNA序列各一个，还包含1~4个tRNA的编码序列•初生转录物的沉降系数为30S（约6000nt），但存在时间很短rRNA操纵子Pre-16SrRNAPre-tRNAPre-23SrRNApre-5SrRNAPre-tRNAPromotersTerminators•大肠杆菌rRNA转录后加工要经历一系列步骤：•转录物通过内部互补序列间的碱基配对折叠形成一些茎环结构。•茎环结构的形成使得一些蛋白与之结合形成核糖核蛋白复合体（RNP）。•在结合完成以后，一些修饰就开始了。3.真核生物rRNA的加工•真核生物中的rRNA也是由一个长的单链前体分子经过特定的修饰和剪切步骤后形成•过程还不是十分清楚•在许多真核生物中，rRNA基因呈串联重复排列，包含100个或更多的转录单位，在核中由RNA聚合酶I转录。•在各种生物体中前体有特定的大小（酵母菌中为7000nt，哺乳动物中为13500nt)，在不同的生物个体之间也有轻微的差异。•前体含18S、5.8S、及28S编码区域的各一拷贝，后两者和起来相当于原核生物中的23SrRNA。•真核生物的5SrRNA由聚合酶III转录散在基因产生出121nt转录物，而且几乎不需要加工。4.核糖核蛋白复合体及其研究•在细胞内，RNA分子通常与蛋白复合存在，特定的蛋白与特定的RNA结合。这种RNA与蛋白复合体称为核糖核蛋白（ribonucleoprotein，RNP）。•核糖体是最大且最复杂的RNP，在加工过程中由rRNA和特定的核糖体蛋白复合而成。•用于研究RNP的方法有：•分离可将RNP纯化后分解为RNA分子与蛋白，然后在分别鉴定•重装配用来发现组分相应结合在一起的规则，如果这些组分可以被修饰，就可以获得一些关于它们各自功能的线索•电子显微镜直接观察RNP•RNP或它们单一组分的抗体来纯化，也可以用来封闭RNP的功能，与电子显微镜联用可以确定特定的组分在整个结构中的大致位置•RNA结合实验显示一种特定蛋白与某一RNA的结合，然后用RNA酶处理RNA-蛋白复合体可以显示出结合蛋白保护了RNA的哪一部分（Raase保护实验）•运用紫外光照射经过和和未经过化学试剂交联的交联实验，可以显示出哪一部分RNA与蛋白分子在复合体中是紧密结合在一起的•中子和X射线最终可以给出RNP完整的三维结构5.原核生物的核糖体•大肠杆菌核糖体占干重的25%（总蛋白的10%和总RNA的80%）。•70S核糖体约为2750KD•由一个50S大亚基和一个30S小亚基组成6.真核生物的核糖体•80S核糖体由一个60S大亚基和一个40S小亚基•大亚基包含大约45种蛋白、一个5SrRNA分子、一个5.8SrRNA及一个28SrRNA分子（后两者相当于原核生物23SrRNA)•小亚基包含18SrRNA和大约30种不同蛋白。•每秒总共可以生成约100万个肽键。二、tRNA的加工、RNA酶P和核酶tRNA3-Dstructure1.原核生物的tRNA加工•成熟的tRNA分子可以从操纵子的前体转录物加工初级转录本RNaseD,E,FandP具有成熟末端的tRNA碱基修饰成熟的tRNA2.真核生物的tRNA加工•真核生物酵母菌tRNA前体含有：•一个16nt5’端前导区•一个14nt内含子•两个额外的3’端核苷酸•初生的转录物形成一个具有特征茎环的二级结构，内切酶正是识别这种结构并切除5’端前导区和2个额外的3’端核苷酸。•3’端的两个核苷酸被切除后，tRNA核酸转移酶将5’-CCA-3’序列添加到tRNA的3’端，产生出成熟的tRNA3’端。（原核生物成熟tRNA3’端的CCA是基因编码的，但真核生物编码tRNA不属于这种情况）•切除内含子，由内切酶将内含子两端切除后，再将两个半个的tRNA分子连接在一起。•酵母菌前tRNA中的内含子可在脊椎动物细胞内加工，真核生物tRNA加工机制在进化中可能是高度保守的。3.核糖核酸酶P•RNaseP是由一个RNA分子和一个蛋白分子组成的一种内切酶，是一种很简单的RNP。•作用：修剪前tRNA分子产生出成熟的5’端。•在原核和真核生物中均有发现。•真核生物中RNaseP位于核内，是一种核内小分子RNP（snRNP)。•在大肠杆菌中，由一个377ntRNA和一个13.7kDa的碱性蛋白组成。•如果向试管中加入前tRNA，单独的RNA组分就可以行使内切核酸酶功能。•这种RNA是一种具有催化活性的RNA，称为核酶，即使无蛋白存在也可催化化学反应。•体外的RNaseP催化反应比体内需更高的镁离子浓度，因此在细胞内蛋白组分可能有助于催化反应。4.核酶（ribozyme）•核酶是一种可以催化特定生化反应的RNA分子。•RNaseP是一种广泛存在可使tRNA成熟的核酶。•自我剪接（self-splicing)：四膜虫rRNA大亚基中有一个内含子，可在无蛋白条件下，对转录物进行体外自我剪接。•需要鸟苷或磷酸化的衍生物作为辅助因子。•体外反应的效率只有体内反应的五十分之一。•核酶可用做治疗用试剂：•纠正突变的mRNA•抑制某些基因的表达•杀死癌细胞•抑制病毒的复制三、mRNA加工、hnRNP和snRNP1.mRNA的加工•原核生物中mRNA转录物根本不需要或很少需要加工。核糖体在mRNA分子的合成未完成前就可以开始翻译。•从5’端开始降解•真核生物RNA聚合酶II转录产物的群体统称为核内不均一RNA（hnRNA)•即将被加工成mRNA分子的转录物被称为前mRNA•前mRNA分子经过5’端加帽、3’端剪切及加多聚A尾巴、剪接和甲基化加工产出成熟的mRNA分子真核mRNA加工2.hnRNP•由RNA聚合酶II合成的hnRNA主要是前mRNA，并很快被蛋白包裹形成核内不均一RNP(hnRNP)。•hnRNP蛋白被认为有助于保持hnRNA的单链状态，并辅助各种RNA加工反应。3.snRNP颗粒•snRNA常与特定蛋白形成snRNP•富含尿嘧啶，因此被命名为U1、U2等•大部分snRNP参与了前rRNA加工中甲基化位点的确定•snRNP的构成过程：•RNA聚合酶II在核中合成，并具有一个正常的5’帽子结构•进入细胞质，与核心蛋白以及其他特定蛋白结合•转运核中，行使剪接功能•在5’端帽子结构上得到两个碱基4.5’端加帽•RNA聚合酶开始转录后不久，在RNA链长度超过20~30nt之前，其5’端经化学修饰被加上一个7-甲基鸟苷残基，这种修饰被称为帽子结构。•与正常的3’-5’连接方式不同，通过一个GMP核苷酸以反方向加到新生的RNA转录物上，从而形成5’-5’三磷酸桥。•催化这一添加核苷酸反应的酶是mRNA鸟苷转移酶•阻止降解（帽子结构对5’外切核酸酶形成屏障，起到稳定转录物的作用）•增加翻译的效率•转运至细胞质中•剪切第一个外显子5.3’端剪切及加尾•对于大多数前mRNA而言，成熟的mRNA分子3’端是经过剪切再加上一串多聚A残基即poluy(A)尾巴而形成的。•剪切和聚腺苷酸化反应需要DNA和前mRNA转录物上的特定序列，即5’-AAUAAA-3’聚腺苷酸化信号序列。•增加mRNA的稳定性•增加翻译效率•剪切最后一个内含子6.剪接•切除内含子将外显子连接在一起的过程称为剪接•发生在核内，而且在成熟的mRNA分子转运到胞质之前•内含子：非编码序列•外显子：编码序列•RNA剪接：切除内含子并连接外显子的过程•Splicingmechanismmustbeprecisetomaintainopenreadingframe•由剪接体催化（mRNA与snRNP的复合物）7.前mRNA的甲基化•许多前mRNA所经历的最终修饰或加工是某些碱基的甲基化•成熟的mRNA中甲基化修饰是高度保守的