第5章分子生物学研究方法上

第五章分子生物学研究方法（上）——DNA、RNA、蛋白质操作技术从20世纪中叶开始，分子生物学研究得到高速发展，主要原因之一是现代分子生物学研究方法，特别是基因操作和基因工程技术的进步。基因操作主要包括DNA分子的切割与连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列分析以及基因的人工合成、定点突变和PCR扩增等，是分子生物学研究的核心技术。5.1重组DNA技术回顾5.2DNA基本操作技术5.3RNA基本操作技术5.4SNP的理论与应用5.5基因克隆技术5.6蛋白质组与蛋白质组学技术本章主要内容：5.1重组DNA技术回顾5.1.1重组DNA技术诞生的理论基础5.1.2关键性实验技术问世为重组DNA技术奠基5.1.3重组DNA技术的概念5.1.4重组DNA技术的基本步骤5.1.5重组DNA技术的意义5.1.6重组DNA实验中常见的主要工具酶5.1.7目的基因的来源5.1.8重组实验中的基因载体5.1重组DNA技术回顾40年代明确了遗传的物质基础是DNA50年代揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制，解决了基因的自我复制和遗传信息传递问题。50年代末和60年代提出了“中心法则”和操纵子学说，并成功地破译了遗传密码，从而阐明了遗传信息的流向和表达问题。5.1.1重组DNA技术诞生的理论基础5.1.2关键性实验技术问世为重组DNA技术奠基1、DNA分子的切割与连接技术限制性核酸内切酶(1972)和连接酶(1967)的陆续发现，才使分子生物学家有了进行DNA操作的基本工具。2、载体构建和大肠杆菌转化体系的建立1970年M.Mandel和A.Hige发现，大肠杆菌的细胞经过氯化钙适当处理之后，便能吸收λ噬菌体的DNA。1972年美国斯坦福大学S.Cohen报道，经氯化钙处理的大肠杆菌细胞也能摄取质粒DNA。大肠杆菌转化体系的建立，对重组DNA技术的创立具有特别重要的意义。3、Southern杂交、DNA序列分析和聚合酶链反应5.1重组DNA技术回顾Southern印迹结果重组DNA技术(recombinantDNAtechnique):是按照人们意愿，在体外对DNA分子进行重组,再将重组分子导入受体细胞，使其在细胞中扩增和繁殖，以获得该DNA的大量拷贝。基因克隆(genecloning)分子克隆(molecularcloning)5.1.3重组DNA技术的概念5.1重组DNA技术回顾克隆——来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合5.1.4重组DNA技术的基本步骤1、四大要素①外源基因（目的基因）②载体③工具酶④受体细胞5.1重组DNA技术回顾2、重组DNA技术的基本步骤①目的基因的获得与载体的制备②目的基因与载体DNA的连接③重组DNA分子导入受体细胞④重组体的筛选与重组DNA的鉴定⑤克隆基因的表达及表达产物的检测与分离纯化5.1重组DNA技术回顾重组DNA技术操作的主要步骤载体质粒噬菌体病毒目的基因（外源基因）基因组DNAcDNA人工合成PCR产物限制酶消化开环载体DNA目的基因连接酶重组体转化体外包装，转染带重组体的宿主筛选表型筛选酶切电泳鉴定菌落原位杂交5.1重组DNA技术回顾重组DNA技术操作过程可形象归纳为：分分离目的基因切限制酶切目的基因与载体接拼接重组体转转入受体细胞筛筛选重组体5.1.5重组DNA技术的意义重组DNA技术填平了生物种属间不可逾越的鸿沟重组DNA技术缩短了进化时间重组DNA技术使人能对生物进行定向改造体外大量扩增、研究其结构、功能及调控机制，从而拓宽了分子生物学的研究领域，这对医学上各种疾病等病因的查明、诊断及治疗具有重大意义。5.1重组DNA技术回顾酶类功能限制性核酸内切酶识别并在特定位点切开DNADNA连接酶通过磷酸二酯键把两个或多个DNA片段连接成一个DNA分子DNA聚合酶Ⅰ按5‘到3’方向加入新的核苷酸，补平DNA双链中的缺口反转录酶按照RNA分子中的碱基序列，根据碱基互补原则合成DNA链多核苷酸激酶把磷酸基团加到多聚核苷酸链的5’-OH末端末端转移酶在双链核酸的3‘末端加上多聚单核苷酸DNA外切酶Ⅲ从DNA链的3’末端逐个切除单核苷酸λ噬菌体DNA外切酶从DNA链的5’末端逐个切除单核苷酸碱性磷酸酯酶切除位于DNA链5’或3’末端的磷酸基团5.1.6重组DNA实验中常见的主要工具酶5.1重组DNA技术回顾限制性核酸内切酶GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease,RE)一类能识别和切割双链DNA分子中特定碱基顺序的核酸水解酶.1972年发现第一个内切核酸酶EcoRⅠ。分类:Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技术中常用Ⅱ型）5.1、重组DNA技术回顾第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。命名HindⅢ属系株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血杆菌d株的第三种酶5.1重组DNA技术回顾Ⅱ类酶识别序列特点——回文结构(palindrome)即反相重复结构，是DNA分子中以某一处为轴，其两侧核苷酸排列呈回文对称的序列。切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGG5.1重组DNA技术回顾BamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口5.1重组DNA技术回顾DNA连接酶:通过磷酸二酯键把两个或多个DNA片断连接成一个整体DNA分子。1967年相继发现。T4¯DNA连接酶EcoRI连接酶T7¯DNA连接酶5.1重组DNA技术回顾1.化学合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列。2.基因组DNA文库(genomicDNAlibrary)3.cDNA文库(cDNAlibrary)4.聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)5.1重组DNA技术回顾5.1.7目的基因的来源化学合成法获取目的基因由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列。组织或细胞染色体DNA基因片断克隆载体重组DNA分子含重组分子的转化菌限制性内切酶受体菌基因组DNA文库存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合从基因组DNA文库获取目的基因限制酶切位点限制酶消化除去中间片段cosLRcoscosL左臂Rcos右臂真核生物染色体DNA限制酶部分消化外源DNA与载体DNA混合连接反应体外包装用重组噬菌体感染大肠杆菌~20KbDNA片段cosLRcos~20Kb外源DNA片段基因文库用随机切割的真核生物染色体DNA片段构建基因文库mRNAcDNA双链cDNA重组DNA分子cDNA文库反转录酶载体受体菌复制从cDNA文库获取目的基因逆转录酶AAAATTTTAAAASI核酸酶DNA聚合酶Ⅰ碱水解TTTT5.1.8重组实验中的基因载体定义：为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。5.1重组DNA技术回顾克隆载体(cloningvector)为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。表达载体(expressionvector)为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。5.1重组DNA技术回顾载体的选择标准能自主复制；具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；分子量小，以容纳较大的外源DNA。5.1重组DNA技术回顾噬菌体载体：双链DNA病毒，约50kb,两端有一个12个核苷酸5′端突出粘性末端λ噬菌体黏粒、YAC、BAC：高容量载体5.1重组DNA技术回顾克隆载体所容纳的外原DNA片段的大小质粒：10kbλ噬菌体：23kb黏粒：45kbBAC：350kbYAC：1000kb5.1重组DNA技术回顾以质粒为载体的DNA克隆过程5.1重组DNA技术回顾5.2DNA基本操作技术5.2.1核酸凝胶电泳技术5.2.2细菌转化与目标DNA分子的增殖5.2.3聚合酶链式反应（PCR）技术5.2.4实时定量PCR技术5.2.5基因组DNA文库构建在生理条件下，核酸分子之戊糖-磷酸骨架中的磷酸基团，呈离子化状态，DNA和RNA多核苷酸链称为多聚阴离子，把它们放置在电场当中，会向正电极的方向迁移。由于戊糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正电极方向迁移。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度，取决于核酸分子本身的大小和构型。这就是应用凝胶电泳技术分离DNA片段的基本原理。5.2DNA基本操作技术5.2.1核酸凝胶电泳技术5.2DNA基本操作技术琼脂糖凝胶电泳：分辨力0.2—50kb（常用）聚丙烯酰胺凝胶电泳：分辨力1—1000bp核酸分析凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小；凝胶浓度越大，空隙越小，其分辨能力越强；反之，凝胶浓度越低，空隙越大，分辨能力越小。2020/4/636在凝胶电泳中，加入溴化乙锭（EtBr）染料对核酸分子进行染色，然后放置在紫外光下观察，可灵敏而快捷地检测出凝胶介质中DNA的谱带部位，即使每条DNA带中仅含有0.05μg的微量DNA，也可以被清晰地检测出来。溴化乙锭能插入到DNA或RNA分子的相邻碱基之间，并在300nm的紫外线照射下发出荧光。5.2DNA基本操作技术荧光染料：溴化乙锭（EtBr）溴化乙锭染料的化学结构及其对DNA分子的插入作用。由于插入了溴化乙锭分子，在紫外光照射下，琼脂糖凝胶电泳中DNA的条带便呈现出橘黄色荧光，易于鉴定。5.2DNA基本操作技术2020/4/640普通的琼脂糖凝胶电泳，很难分离大于50kb的DNA分子，而要进行超大分子研究，要用到脉冲电场凝胶电泳。5.2DNA基本操作技术2020/4/641所谓细菌转化，是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的DNA而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。提供转化DNA的菌株叫作供体菌株；接受转化DNA的细菌菌株则被称为受体菌株。5.2.2细菌转化与目标DNA分子的增殖5.2DNA基本操作技术5.2DNA基本操作技术转化（transformation）：P163感受态细胞（Competentcells）：受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，能容许有外源DNA的载体分子通过，处于这种状态下的细胞称~将异源DNA分子引入一细胞株系，使受体细胞获得新的遗传性状转导？转染？感染？常用的转化方法：化学转化（CaCl2）法电击法重组DNA分子的体外包装法5.2DNA基本操作技术化学转化原理：—将快速生长中的大肠杆菌置于0℃冷冻处理时，处于CaCl2低渗溶液中的大肠杆菌细胞膨胀成球形，DNA可吸附于其表面。—在42℃下做短暂的热刺激下，外源DNA即被细胞吸收。—将转化后的细胞在选择培养基上培养，筛选出带有外源DNA分子的阳性克隆。—阳性克隆在全培养基中生长一段时间使转化基因实现表达。5.2DNA基本操作技术CaCl2法是制备大肠杆菌感受态细胞最常用的方法。电击转化：一种高效方法。使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体DNA分子导入受体细胞。菌液：生长对数期场强(最大转化效率)：12.5-15kV/cm温度：0-4℃5.2DNA基本操作技术P1655.2DNA基本操作技术重组DNA分子的体外包装法5.2DNA基本操作技术DNA克隆的筛选：抗生素抗性基因。常用的抗生素有：氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、四环素、链霉素等-互补蓝白斑筛选营养条件（自养、异养）5.2DNA基本操作技术Antibioticresistancegenes5.2DNA基本操作技术directselectionTheproceduretoformrecombinantDNA-