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园艺植物组织培养HorticulturePlantTissueCulture马慧丽/李学强xiaoma77@sohu.com15824919894答疑地点：2-410（周一15:00-17:00）主要参考资料《植物组织培养教程》李浚明．《植物组织培养》吴殿星，胡繁荣．《植物组织培养》陈世昌．《植物细胞工程实验技术》孙敬三，朱至清．《植物细胞工程实验技术》孙敬三，桂耀林．《植物组织培养手册》颜昌敬．《实用植物组织培养技术教程》曹孜义，刘国民《植物组织培养实用技术》朱建华，彭士勇《植物细胞工程原理与技术》周维燕《植物细胞组织培养》刘庆昌，吴国良1绪论1.1植物组织培养的一般概念1.2植物组织培养的发展简史1.3组织培养与农业的关系1.1植物组织培养的一般概念植物组织培养(planttissueculture)（广义的）：在无菌条件下利用人工培养基对植物的组织、器官、细胞以及原生质体进行培养，使之产生再生的完整植株或其它具有经济价值的生物产品的技术。外植体(explant)：由活植物体上切取下来用以培养的那部分组织、器官等。根据外植体的种类不同组织培养可分为：器官培养（organculture）：外植体为器官的全部或部分或器官原基组织培养（tissueculture）(狭义的)：外植体为植物的各部分组织细胞培养（cellculture）：外植体为单细胞或很小的细胞团原生质体培养（protoplastculture）：外植体为除去细胞壁的原生质体1.2植物组织培养的发展简史探索阶段（20世纪初至20世纪30年代中）：1902年德国的植物生理学家Haberlandt以小野芝麻、凤眼蓝的栅栏组织和虎眼万年青属植物的表皮细胞等的单个离体细胞培养在加了蔗糖的Knop溶液中，但未成功。之后进展不大，直到1934年White培养番茄离体根尖成功。奠基阶段（20世纪30年代中至20世纪50年代末）通过对培养基成分和培养条件的广泛研究，实现了离体细胞生长和分化的控制，初步建立了组织培养的技术体系，并首次用试验证明了细胞全能性的设想。在此阶段发现了B族维生素、生长素和细胞分裂素在组织培养中的作用。Gautheret，White，Nobecourt一起被誉为植物组织培养的奠基人。迅速发展和逐步实用化阶段（20世纪60年代至现在）原生质体培养取得重大突破（烟草）；花药培养取得显著成绩（由于单倍体在突变选择和加速杂合体纯合化过程中的重要作用，主要在烟草、水稻、小麦）；微繁技术得到广泛应用（如兰花，观赏植物及林木、果树、蔬菜中离体快繁达到工厂化规模）。细胞融合技术应运而生（烟草种间、马铃薯和番茄的体细胞杂种）与分子生物学联姻，产生转基因育种技术（定向改变了植物的遗传性，如转基因抗虫棉、抗虫玉米、抗除草剂大豆和抗虫油菜等）1.3组织培养与农业的关系快速无性繁殖获得脱毒苗保存种质资源选择体细胞突变体突变的诱导和离体选择克服远缘杂交的一些障碍进行体细胞杂交控制倍性提供外源基因转化的受体2组培室的基本设备和一般技术2.1基本设配2.1.1实验室构成（准备室、灭菌室、培养基配制室、无菌操作室、培养室、鉴定室、驯化移植室）1.准备室需备有的设备有：鼓风干燥箱、落水架、工作台、水池、水桶、水盆、试管刷等，还需要有高压水龙头用于冲洗,主要用于玻璃器皿、用具和培养材料清洗。2.灭菌室需备有高压蒸汽灭菌装置、细菌过滤器、用于培养基及培养器械的灭菌。3.培养基配制室需备有冰箱、化学实验台、药品柜、器械柜、物品存放架以及各种玻璃器皿和用具，包括各种不同容积的容量瓶、烧杯、量筒、移液管、三角瓶、磨口瓶、广口瓶、各种类型培养瓶、玻璃棒、移液管架、试管刷、电炉、微波炉等。4.无菌操作室(接种室)无菌操作室在工作方便的前提下，宜小不宜大，宜精细密闭，忌粗陋放散，是植物组织培养研究或生产工作中最关键的部分，关系到培养物的污染率，接种工作效率等重要指标。要求如下:(1)地面、天花板及四壁尽可能光洁、避免积染灰尘，易于采取各种清洁措施。(2)干爽、安静、清洁明亮，在适当的位置吊装紫外灯1-2盏，用以经常照射灭菌，使室内保持良好的无菌、低密度有菌状态。(3)最好安置一小型空调机，使室内温度保持在26℃左右，这样就可以在工作时或不工作时都把工作室的门窗紧闭，保持与外界相对隔绝的状态，尽量减少与外界的空气对流，减少尘埃与微生物侵入。(4)经常采用消毒措施，达到较高的无菌水平，以利完全操作提高工作的质量与效率。(5)无菌室外应留有缓冲间，进入无菌室前在此更衣换鞋洗手及处理外界采回准备消毒培养的材料等。无菌操作室应备有超净工作台或接种箱、固定式载物台、移动式载物台、广口瓶、酒精灯、纱布、器械支架、手术剪、解剖刀、解剖针、镊子等。5.培养室应尽量安排在楼层较高处，以利于采光，减少尘埃和杂菌污染的机会。此外应考虑清洁、干燥，培养室保温隔热。培养室中距离窗户较远处的培养架应适当安装人工辅助照明的日光灯。应设计能有效通风的窗户、定期或需要时加强通风散热，如在室内地板稍高处设置进风气窗，在气窗的对侧近天花板设置排风窗，也可安装小功率的排风扇。室内应备有制冷设备、加热设备、控光设备、固定式培养架、旋转式培养架、摇床等。6.鉴定室需备有高倍显微镜、倒置显微镜、相差显微镜、解剖镜、恒温箱、切片机、烤片台、恒温水浴、滴瓶、染色缸、载玻片、盖玻片等。7.驯化移植室应备有温室、弥雾装置、荫棚、移植床、钵、盆、塑料布、草炭、蛭石、粗沙等，用于试管小植株的锻炼和移植。2.1.2基本设备清洗设配：冷热水源、水槽、各种毛刷、塑料桶或盆、鼓风干燥箱、防尘厨培养容器：培养皿、三角瓶、广口瓶、试管玻璃器皿：最好用硅酸盐玻璃器皿，钠玻璃器皿对某些组织可能有毒。空调25℃±2℃人工气候箱、培养箱培养架、光源（可控）试管架（铁丝制成）摇床（温光可控式摇床）多用途小车培养容器材料：聚丙烯(PP)、聚碳酸脂(PC)无菌培养容器封口膜培养架枪镊直镊手术刀柄手术刀片手术剪接种工具灭菌器手提式灭菌锅立式灭菌锅卧式圆形压力蒸气灭菌器单人单面超净台双人水平净化工作台生化培养箱光照培养箱真空干燥箱干热灭菌器洗瓶机：采用清水里外冲冼，可洗广口瓶、三角瓶。超声波清洗器针头过滤器（用于组培中不耐高温激素的过滤除菌）磁力搅拌器移液器架移液器4910(整支可消毒系列)2.2一般技术2.2.1玻璃器皿和塑料器皿的清洗洗液（重铬酸钾和浓硫酸混合液）浸泡4h，然后用水冲洗干净，直到不留任何残迹。新玻璃器皿因有游离碱性物质，使用前先用1%稀盐酸浸泡一夜，然后用肥皂水洗净，清水冲洗，最后用蒸馏水冲洗一次，干后备用。被污染的旧器皿灭菌洗涤，方法同新器皿，但浸泡时间可短。烘干75℃左右，口向下,贮存防尘厨2.2.2灭菌培养基污染来源：培养容器、培养基本身、外植体、接种室的环境、操作器械、培养室的环境。（1）培养基灭菌培养基装瓶封口灭菌灭菌条件：一般条件1.06kg／cm2121℃消毒15～40min表2-1培养基蒸汽灭菌所需的最少时间容积（ml）在121℃下所需的最少灭菌时间（min）1~20015200~1000301000~200040注意：冷却时要缓慢降温。与热易分解的物质如某些生长调节剂（如GA3、IAA、ABA、玉米素）、尿素、某些维生素、酶等不能进行高压灭菌。上述物质可通过滤膜进行灭菌，之后加入高压灭菌后的培养基中（培养基温度40℃）。滤膜孔径≤0.45μm(2)玻璃器皿、塑料器皿和器械高压蒸汽灭菌:同培养基灭菌,塑料器皿因材料而定，聚丙烯、聚甲基戊烯、同质异晶聚合物可以在121℃反复进行高压蒸汽灭菌；聚碳酸酯类每次灭菌时间不超20min。干热灭菌：玻璃器皿160~180℃3h；灼烧灭菌：95％酒精（3）植物材料植物材料各部分的表面都可能携带污染微生物，必须进行表面灭菌。内部感染真菌或细菌的植物材料一般弃之不用。可用各种消毒剂进行植物组织消毒，常用消毒剂如表2-2所示。表2-2一些表面消毒剂的消毒效果消毒剂使用浓度消毒时间（min）消毒效果次氯酸钙5％～10％5~30很好次氯酸钠2％5~30很好过氧化氢10％～12％5~15好溴水1％～2％2~10很好硝酸银1％5~30好氯化汞0.1％～1％2~10满意抗生素4～50mg／g30~60相当好注意：表面消毒剂对植物组织也是有毒的，必须正确选择消毒剂的浓度和处理时间，以尽量减少组织的死亡。可同时用两种或多种消毒剂，如常用酒精和升汞同时处理。消毒剂里也可加几滴表面活化剂如Triton-X、Tween-80等，以提高杀毒效果。不同的外植体采用不同的处理方法。如外植体较大，直接灭菌处理，如大戟科植物的成熟种子或成熟胚乳的培养，可直接消毒种子或去皮种子；如果培养未成熟胚珠、胚或胚乳，习惯上的办法是分别把子房或胚珠进行表面消毒，然后在无菌条件下把外植体解剖出来；如果是茎尖或花粉等柔嫩部分，一般将茎芽或花蕾消毒。如果外植体表面污染严重，需用流水冲洗1h或更长时间，或先进行室内培养以得到污染轻的外植体。外植体消毒的一般步骤流水冲洗30～60min70%酒精30～60s植物组织＋消毒液（带盖的玻璃瓶或其它容器）＋(活化剂)摇动2～3次蒸馏水冲2～3次放入消过毒的培养皿中（4）接种区消毒超净工作台原理：电风扇粗过滤器细过滤器（高效过滤器）滤掉0.3μm的颗粒超净空气吹过台面，风速27±3m／min，这个速度足以阻止工作区被坐在工作台前面的所污染，所有的污染物都会被这种超净气流吹跑，但这种气流不妨碍在台面上使用酒精灯。只要超净工作台不停的运转，台面上即可保持一个无菌的环境。初次使用应在开动20分钟后再开始操作，以后开动10分钟即可。每次操作前，必须把所需材料全部拿进。台面上的东西不能阻挡气流。