肾功能及肾损伤标志物——中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)解析

肾功能及肾损伤标志物——中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（NGAL）解析中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（NGAL）是lipocalin的一种，最初是在激活中性粒细胞中被发现的一种小分子量分泌性蛋白，现代研究表明，NGAL是诊断急性肾损伤的最有效生物学标志物之一。NGAL的合成及分布NGAL由肾小管细胞、中性粒细胞等细胞类型合成，它标志性的存在于循环内，可被肾小球自由滤过，并被肾小管上皮细胞截获降解。肾功能异常时，引起肾小管上皮细胞损伤，分泌大量的NGAL，大量NGAL通过诱导肾小管间质中浸润的中性粒细胞发生凋亡从而保护肾组织免受炎性细胞的损害，以此诱导肾小管上皮细胞再生。NGAL在肾脏中的表达会因多种原因的肾损伤而显著升高，并且释放到尿液和血浆中。正常情况下，NGAL在尿液和血浆中维持一个较低水平，而肾损伤时则在非常短的时间（2-4h左右）急速升高。NGAL在AKI中的应用NGAL用于AKI的早期诊断急性肾功能损伤(AKI)时血、尿NGAL浓度会迅速升高，2h最为明显(比临界值升高几十至几百倍)，而血清肌酐(sCr)、尿酶等传统指标往往要在24～72h后才明显升高，因而NGAL可用于AKI的早期诊断。大量研究证明，肾脏在顺铂诱导的肾脏急性损伤后约2h就能在尿中检测到NGAL，而检测出血肌酐明显改变要在等到3-4d后，同样在肾脏急性缺血再灌注损伤后3h在尿中也能检测到NGAL。儿童心脏手术后发生急性肾功能衰竭的患者在手术后2h血、尿NGAL的浓度明显升高，而血肌酐明显升高则要等到1～3d后。NGAL可用于AKI的鉴别诊断尿NGAL可鉴别AKI、肾前氨血症、慢性肾病和正常肾功能病人。NGAL可用于AKI的危险分层ICU诊断中NGAL能够预测急性肾损伤的严重程度；NGAL对不同程度的AKI诊断体现出高灵敏性和特异性。NGAL可用于AKI临床结果的预测（发病率、死亡率等）评估预后，NGAL可作为AKI的预后指标之一。体外循环术患者术后2、4、6h尿NGAL水平与AKI的持续时间、患者住院时间长短均显著相关，2h尿NGAL还与AKI的严重程度(是否需要透析治疗)及患者病死率明显相关。NGAL与Cys-C的对比NGAL是一个比Cys-C更早出现的生物标志物。一项前瞻性研究，比较了心脏分流术后发生AKI患者中血NGAL和血Cys-C对AKI的预测能力，129例患者中有41例分别在术后1～3d发生AKI。发展为AKI患者中，血NGAL值在术后2h升高，Cys-C在术后12h升高，NGAL在时间上早于Cys-C。这可能是因为，NGAL是肾损伤的结构性标志物，在肾小管或浸润性免疫细胞损伤即可上调并释放到血和尿中；而Cys-C是肾功能性标志物，Cys-C通过肾小球滤过，肾小管重吸收降解进行代谢。结构变化一般发生在功能障碍之前，所以NGAL比Cys-C出现更早。在AKI早期诊断中，NGAL指标更优于Cys-C。结构变化，一般发生在功能性障碍之前因此，在肾损伤时，NGAL是较传统的神功标志物出现更早的标志物。NGAL在其他疾病中的临床应用NGAL与肾移植NGAL在肾移植中也可作为诊断标志物肾移植时因缺血-再灌注所致AKI使移植肾功能延迟，导致移植术后１周内患者需接受透析治疗。移植肾活检显示NGAL染色强度与移植后肾功能的延迟正相关。肾移植患者和慢性肾损伤患者血清NGAL肌酐显著升高GFR估计值GFR显著降低。使用NGAL、胱抑素Ｃ对肾移植患者预后的预测时发现：NGAL在肾移植前、后各时间点与肌酐、胱抑素Ｃ均具有正相关性，而与尿量呈负相关。移植肾功能延迟患者的NGAL、胱抑素Ｃ水平未见下降，提示NGAL可能作为预测移植肾功能延迟的早期预测指标，尤其对指导肾移植患者早期透析和抗排斥治疗具有重要价值。综上所述，对肾移植术后患者监测NGAL水平可早期发现移植肾功能延迟，及时进行对症处理，如血透、移植肾切除等。NGAL与慢性肾损伤NGAL作为AKI标志物已被广泛报道。CKD患者其尿NGAL水平显著高于健康者，患者GFR水平显著低于健康者，且尿NGAL与GFR具负相关。对尿NGAL、尿蛋白、尿微量清蛋白、GFR两两之间的相关性分析显示尿NGAL可作为CKD诊断的可靠指标。NGAL与狼疮性肾炎尿NGAL是预测狼疮性肾炎的敏感、特异指标。其预测狼疮性肾炎的敏感性和特异性高于ds-DNA。研究发现累及肾脏的系统性红斑狼疮患者，NGAL分泌量与血清肌酐和肌酐清除率正相关。但与SLE活动度评分指数无相关性，多元线性回归分析发现尿NGAL判断SLE患者肾脏损伤的特异性和敏感性高于ds-DNA。NGAL与肿瘤NGAL是一种分泌型急性反应时相蛋白。在乳腺癌、肺癌、胰腺癌等组织中上调表达。分化好的胰腺癌细胞高表达NGAL，而分化相对差的癌细胞极少表达NGAL。直肠癌组织直肠癌组织NGALmRNA过表达与肿瘤细胞浸润深度、淋巴结转移、静脉受累及肿瘤TNM分期相关。总之，NGAL在抑制肿瘤细胞黏附、转移、血管生成等方面具有应用价值。NGAL与冠心病SA、UA、NSTEMI、STEMI患者血清。NGAL水平与hs-CRP白细胞数显著正相关，提示血清NGAL可反映冠状动脉综合征患者的炎症水平。其血清NGAL具有较高的阴性预测值，并通过对炎症水平的反映而预测疾病的严重程度。NGAL临床应用项目优势1、监测时间早：NGAL可以在肾脏发生损伤2小时内就显著升高。血清肌酐、尿素氮需要3-4天才有明显升高；胱抑素C、微球蛋白需要在20小时左右有显著升高。2、易于判断：NGAL提示值是正常样本含量的数百倍，这样可避免检验系统误差造成临界值不好判断的情况。3、特异性高：在单一研究中心的均质患者人群中，NGAL是特异性最好的预测AKI的指标。NGAL检测样本血尿均可研究表明，尿液中NGAL主要来自受损的肾脏上皮细胞，而且尿液标本便于采集，故检测尿液NGAL具有窗口期短、快速、便捷、无创等优点。NGAL不仅存在于尿液中，同样也存在于血浆中。血浆中NGAL浓度的测定对AKI的早期诊断也有重要价值，因为它既能避免因极度少尿带来的麻烦，又能减轻因治疗而使用利尿药等带来的干扰。NGAL检测的适用科室与适应症ICU：大型手术术后的急性肾损伤诊断；危重病情监测以及预后评估、休克心内科：心脏术后急性肾损伤诊断、心衰并发的急性肾损伤、对比剂急性肾损伤早期诊断、心肾综合征诊断神经内科：对比剂致急性肾损伤早期诊断大型手术科室：如骨科、外科等其它有可能发生急性肾损伤的科室人NAGL单克隆抗体科赛格最新推出的人NGAL单克隆抗体，通过化学发光和胶乳免疫比浊平台对NGAL单抗性能进行反复验证，并利用不同的抗体组合对多份临床样本进行检测，与一家高质量的比对试剂的结果具有高度一致性，证明NGAL单抗适用于化学发光和胶乳免疫比浊法试剂。校准曲线A.化学发光平台所有的单克隆抗体分别用作捕获抗体和标记抗体，组合成不同抗体对，用于双抗夹心法免疫检测。不同抗体对检测不同浓度的NGAL，进行四参数logistic拟合（图1），结果显示R²0.99，配对组合理想。配对方式如下（捕获抗体-标记抗体）：MAbcombinationA:CSB-DA001DmN①-CSB-DA001AmN①MAbcombinationB:CSB-DA001AmN①-CSB-DA001DmN①MAbcombinationC:CSB-DA001AmN②-CSB-DA001DmN①MAbcombinationD:CSB-DA001AmN③-CSB-DA001DmN①▲图1.不同NGAL抗体组合测NGAL的校准曲线B.胶乳比浊平台将几种单抗混合包被于胶乳颗粒，制备成胶乳试剂，检测0∼5000ng/mL的NGAL校准品，建立校准品浓度与反应吸光值的对应关系，进行线性回归拟合，如图2。▲图2.抗人NGAL单抗检测NGAL的校准曲线临床比对A.化学发光平台为验证抗体对适用于临床检测，利用抗体对组合（A、B、C和D组合）对50例临床样本进行检测，并与一家高质量的诊断试剂测值进行对比，检测结果如图3，此结果表明四种组合检测数据与比对试剂相关性较好。▲图3.不同NGAL抗体组合应用于化学发光平台对临床样本的检测B.胶乳比浊平台为验证抗体是否适用于胶乳增强免疫比浊法，将本公司的自产抗体制成胶乳比浊试剂和一家高质量的诊断试剂同时对血清样本进行检测，两者相关性高达0.97（图4），说明本公司自产单抗适用于胶乳增强免疫比浊试剂。▲图4.自产抗体和比对试剂对血样的检测热稳定性将四种NGAL单克隆抗体置于-20℃、2-8℃和37℃，每隔3天测抗体的效价，从图5可以看出在2-8℃和37℃条件下抗体的滴度与-20℃条件维持在一定水平，说明该抗体稳定性好。▲图5.四种NGAL单抗的稳定性测定将NGAL单抗于4℃和37℃分别放置7天，再分别偶联至胶乳颗粒，然后在同一条件下检测不同浓度的NGAL校准品，结果如表1，37℃热处理的抗体相对于4℃存放，在检测性能方面变化很小，说明该抗体稳定性合格。▲表1.不同温度处理后的单抗对NGAL检测的比较人NGAL多克隆抗体科赛格最新研发的人NGAL多克隆抗体，通过胶乳平台对NGAL多抗性能进行反复验证，采用自产的多抗应用于胶乳试剂和比对试剂同时检测多份随机样本，证明NGAL多抗可以用于体外诊断。校准曲线将NGAL兔多抗偶联至胶乳颗粒，检测0-4900ng/ml蛋白，样本中的NGAL会与胶乳上的多抗反应，使胶乳颗粒凝集，从而提高溶液的浊度。根据NGAL浓度与吸光值的对应关系，拟合四参数Logistic曲线（图6）。▲图6.多抗胶乳试剂对不同浓度NGAL检测（胶乳增强免疫比浊法）临床比对利用外购高质量的比对试剂和本公司多抗制成胶乳试剂对50份随机样本进行检测，结果如下图7，两者相关系数高达0.98，表明本公司自产的多克隆抗体可以用于临床检测试剂中。▲图7.自产多抗配制试剂与外购比对试剂对临床样本测值的比较（胶乳增强免疫比浊法）稳定性将多抗（未加保护剂）置于37℃加热处理7天后，然后偶联至胶乳颗粒，制备成胶乳试剂，检测不同浓度下的NGAL校准品，与未加热处理组比较（表2）。结果显示两者偏差不大，说明多抗比较稳定。▲表2.不同温度处理后的多抗对NGAL检测的比较NGAL蛋白科赛格同时还提供高质量的人NGAL蛋白，货号为CSB-DP001A。该蛋白以液体形式供应，用SDS-PAGE检测蛋白纯度在95%以上，可以用于免疫测试的校准品、免疫印迹（WB)等方面。参考文献1.MishraJ,DentC,TarabishiR,etal.Neutrophilgelatinase-associatedlipocalin(NGAL)asabiomarkerforacuterenalinjuryaftercardiacsurgery［J］.Lancet,2005,365(9466):1231-1238.2.BolignanoD,LacquanitiA,CoppolinoG,etal.Neutrophilgelatinase-associatedlipocalin(NGAL)andprogressionofchronickidneydisease［J］.ClinJAmSocNephrol,2009,4(2):337-344.3.许文燊.中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白——一种新的肾损伤标志物[J].临床检验杂志,2011,29(4):285-287.4.蔡彦,梅长林.中性粒细胞明胶酶相关性脂质运载蛋白临床应用研究进展[J].中华内科杂志,2012,51(8):660-662.