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第六章人工授精Chapter6ArtificialInsemination本章内容第一节概述Section1Introduction第二节采精Section2Semencollection第三节精液品质检查Section3Semenqualityexamination第四节精液的稀释Section4Semenextendandextenders第五节精液保存Section5Semenstorage第六节输精Section6Insemination第一节概述一、概念二、意义三、AI发展概况一、AI概念利用器械采集公畜的精液，经检查和处理后，再用器械将精液输入到母畜生殖道的适当部位，使之妊娠，以此来代替公母畜自然交配一种科学配种方法。二、人工授精的优越性提高了优良种公畜的配种效能和种用价值，降低了饲养管理费用；加速家畜品种改良，促进育种工作；防止各种疾病，特别是生殖道传染病的传播；有利于提高母畜的受胎率；克服地域限制和杂交改良的大小悬殊困难；优越性为开展胚胎移植、同期发情等繁殖技术研究提供了有效手段。三、人工授精的局限性通过人工授精可能使不良公畜的影响范围更大；必须投入一定资金，进行房舍建设和设备购置；必须进行人员的技术培训，不良的操作会造成更严重的问题。四、AI的发展简况实用阶段冷冻精液阶段试验阶段1780年，意大利生理学家Spallanzani，第一次成功地用狗进行了人工授精试验；上世纪40-60年代，人工授精的应用蓬勃发展成为繁殖改良家畜的重要手段。以乳牛的普及率最高，发展最快，技术水平较高；50年代英国的Smith和Polge研究牛精液的冷冻保存方法，人工授精技术进入了一个新的发展阶段。我国人工授精技术发展史1935年60-70年代70-80年代初在江苏句容马场试验成功；在北方开展马、绵羊人工授精，推动马、细毛羊品种育种；60年代开展牛人工授精，70年代冷冻精液；猪人工授精，尤江苏好，并建立良种推广站。50年代第二节采精一、采精前的准备Preparations二、采精方法Collectingmethods三、采精频率Frequencyofsemencollection第三节精液品质检查检查的目的检查精液品质的优劣，判定种公畜的配种能力检查公畜的繁殖问题确定精液可稀释的倍数检查精液的处理方法是否正确采精时精液是否受到污染和采精技术好坏程度的工作。内容：外观检查显微镜检查（精子活率、密度、形态）微生物检查精子代谢能力检查其他检查（受胎效果）一、精液外观性状检查法（一）精液量(ml)奶牛：5-10；肉牛：4-8；绵羊：0.8-1.2；猪：150-300；山羊：0.5-1.5；马：30-100050100150200250奶牛水牛马猪绵羊山羊射精量（二）颜色与气味一般为乳白色或灰白色。气味略有腥味。正常精液特征依从浓到稀：乳黄-乳白-白色-灰白淡红（鲜红）生殖道下段出血或龟头出血淡红（暗红）副性腺或生殖道出血绿副性腺或尿生殖道化脓黄混有尿液(三)云雾状浓份精液因精子密度大、活力强，使精液翻腾呈现旋涡云雾状。（四）pH值牛、羊精液pH值为6.5-6.9,猪、马为7.4-7.5。一般同种精液pH值较低的品质较好。（五）杂质如被毛、脱落上皮、炎性分泌物、灰尘、纤丝。二、精子活率检查精子活率：在显微镜下观察，在一个视野内向直线前进运动的精子占全部精子总数的百分率。一般在37-38°C温度下进行评定，牛、羊精液尚需用生理盐水作稀释后才能评定。活力一般用0-1.0的10级评分，一般新鲜采精液活率应该为0.7~0.8左右。三、精子密度的检查精子密度：是指单位体积（ml）精液内所含有的精子数。畜种牛羊猪马鸡密度亿/ml8-1220-302-31.5-330-50010203040牛羊猪马鸡亿/ml(一）目测法：在低倍显微镜下根据精子之间的距离来定，分为密、中和稀三等。（二）血细胞计数法：精子数量/ml=5×5×10×1000×稀释倍数（三）光电比色法：是根据精子的透光性而测定精子数的方法。透光性越高，则精子数越少，透光性越差，则精子数越多。现在甚至可与计算机联接，立即知道被测精液的活率和密度。（四）流式细胞仪四、精子的形态检查1、精子畸形率：头部、颈部、尾部，观察200个精子，求出比例。用于输精的精子畸形率不得超过20%。头部：巨大，细小，缺失，双头，轮廓不明显，皱缩颈部：臌大，纤细，弯曲，不全，原生质滴尾部：屈折，带原生质滴，双尾，折断，纤细畸形精子类型图双头和双尾精子顶体与精子受精能力直接有关，牛超过14%，猪超过4.3%时会直接影响受胎率。2、精子顶体异常率精子顶体异常图五、精子代谢能力检查（一）精子生存时间和生存指数精子生存时间：指精子在体外一定条件下（稀释液、稀释倍数、保存温度和方法等）的总生存时间。具体算法：所有间隔时间累加后减去最后两次间隔时间的一半即为精子的存活时间。精子生存指数：相邻两次检查的间隔时间与平均活力的积之和。是精子存活时间与精子活率下降变化的一项综合指标。精子生存时间越长，则生存指数越大，说明精子生活力越强，品质越好。检查时间间隔时间(h)活率2次检查平均活率h×平均活率日/月时间6/4600.8—1480.60.75.62280.50.554.47/4680.30.43.21480.20.252.02280.10.151.28/468摆动0.050.4∑=48∑=16.8生存时间：48-8/2=44h生存指数：h×平均活率=16.8（二）美蓝褪色试验美蓝是氧化还原剂，氧化呈蓝色，还原呈无色，精子在美蓝溶液中，呼吸时氧化脱氢，美蓝获得H+后便使蓝色还原为无色。因此，根据美蓝褪色时间可测知精液中存活精子数量多少，判定精子的活率和密度高低。（三）精液果糖分解测定精液果糖分解能力与精子活力密切相关，因此测定一亿精子每小时消耗果糖的mg数来表示精子的果糖分解能力，甚至反映精子活率和密度的高低。第四节精液的稀释Section4Semendilution一、精液稀释的目的Aimsofsemendilution二、稀释液的成分及作用Compositionofextenders(diluents)三、稀释液的种类和配制Typesandmake-upofextenders(diluents)四、精液稀释方法和稀释倍数Methodsandmultipleofsemendilution一、精液稀释目的1、精液稀释定义：往精液中加入适宜于精子体外存活，保持其受精能力的溶液。2、精液稀释目的（1）扩大精液量—增加可配母畜头数；（2）延长存活时间；（3）便于运输和保存。二、精液稀释液的成分及作用扩大容量用。如生理盐水、等渗葡萄糖等。提供精子营养、能量。如糖类、卵黄、奶类。有激素类、酶类、维生素类。营养物质其它添加剂稀释剂保护剂保护精子免受外界影响。如甘油、抗菌剂。三、稀释液的种类和配置（一）稀释液的种类1、现用稀释液奶类和等渗糖类为主。2、常温保存稀释液用于常温保存精液，pH较低。3、低温保存稀释液用于低温保存精液，含有卵黄和奶类等抗冷休克物质。4、冷冻保存稀释液用于冷冻保存精液，含抗冻物质如甘油DMSO。（二）稀释液的配制方法用具先清洗、消毒、干燥先配制基础液水浴消毒准确称取药品、量取定量的蒸馏水冷却后按比例加入抗生素、卵黄、甘油溶解过滤冷却四、稀释方法和稀释倍数立即稀释精液经检查合格后应立即进行稀释，越快越好等温稀释稀释时，稀释液的温度和精液的温度必须调整一致，以30-35℃为宜；缓慢稀释稀释时，将稀释液沿精液瓶或玻璃棒缓慢倒入，同时摇动精液瓶稀释；分次稀释若作高倍稀释，应先低倍后高倍，分次进行稀释；稀释后立即镜检，活力应和稀释前一样；稀释后精液立即进行分装（一般按一头母畜的输精量）保存。（一）稀释方法（二）稀释倍数确定精液稀释倍数应依据精液的密度、活率及有效精子数。家畜精液的稀释倍数稀释倍数的计算原精液的有效精子数密度×使用前精液活力稀释后要达到的有效精子数每剂量要求的有效精子数÷剂量计算稀释倍数原精液的有效精子数÷稀释后要达到的有效精子数精液分装数的计算原精液量×稀释倍数÷剂量现行的精液保存方式有三种：常温保存（15-25℃）低温保存（0-5℃）冷冻保存（-79℃或-196℃）第五节精液的保存Section5SemenStorage液态保存固态保存一、常温保存（15-25℃），变温保存1、原理：是利用一定范围的酸性环境，抑制精子的活动，使精子保持可逆的静止状态而不丧失受精力。2、稀释液：（1）能量物：如葡萄糖；（2）缓冲体系：如柠檬酸钠、碳酸氢钠；（3）抗生素：如青、链霉素等。3、方法：隔水降温。天热时，尽可能降低保存温度如放入水井、水缸；天冷时，放在有暖气的室内。适合猪精液保存（15～17℃）二、低温保存（0-5℃）1、原理：利用较低的温度来减弱精子的活动和代谢，从而延长精子的生命。2、低温保存稀释液：除室温保存液应具有的成分外（不充CO2），在牛用的稀释液还需用加卵黄或牛奶。为何要添加？3、保存前的处理（1）稀释分装：低温保存的精液通常用玻璃或塑料瓶分装，瓶内尽量不留空气，然后封口;（2）降温处理：通常按0.2℃/min降至保存温度;（3）保存方法：牛羊精液置于0~5℃，猪精液须特殊改造的冰箱或用泡沫盒内放冰块，精液用一块泡沫垫在上面；（看后图）（4）低温保存精液的利用：低温保存的精液在使用前应该用水浴升温至30℃。4、液态精液的运输（1）包装好、做好标记（种类、品种、畜号、时间）；（2）运输中避光、防震并保持温度。三、精液冷冻保存(-79℃或-196℃)定义：是利用液态氮（-196℃）或干冰（-79℃），作为冷源，将精子和精液冷冻成固体，并在液态氮或干冰中作超低温永久保存。意义：（１）提高优良种公畜的配种效能；（２）便于冷冻精液的自动化生产；（３）便于引种；（４）加快改良和育种；（５）推进繁殖新技术的应用；（６）建立动物基因库。（一）精液冷冻保存原理目前关于精液冷冻的原理普遍倾向于玻璃化学说。原理：利用超低温使精液和精子快速冷冻，快速越过形成冰晶的温度范围（0~-60℃）、精液或精子中的水分不形成冰晶，而是形成玻璃化。同时在抗冻剂的存在下使精子免受冻伤，在温度上升至体温精液解冻后精子能够保持完整的形态结构、功能和受精能力。液态→固态结晶态：缓慢降温形成。水分子有序形成冰晶对精子有害：机械和渗透压损伤。玻璃态：快速降温形成。水分子无序形成玻璃样的超微粒结晶，对精子无害。（0～-60℃）（-15～-25℃）（-60～-250℃）1、冷冻时细胞的损伤冰晶：在0～-60℃低温区，缓慢降温条件下形成的，降温越慢，冰晶越大，-15～-25℃对精子危害最大。冰晶的形成对精子造成的机械损伤和渗透压损伤是引起精子死亡的主要物理因素。玻璃化：在-60～-250℃超低温区，从冰晶化区域内开始，就快速降温，迅速越过冰晶化进入玻璃化阶段，此阶段对精子无害。2、添加冷冻保护剂（甘油，DMSO等）作用：增强精子抗冻能力，并对防止冰晶发生起到重要作用。（二）精液冷冻保存稀释液除与精液低温保存液相同外，尚需用加抗冻剂。1、牛用：主要有卵黄-柠檬酸钠-甘油液，卵黄-糖类-甘油液，奶类-甘油液等3种。甘油浓度以5%-7%为宜。2、猪用：一般采用以葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘油为主要成分的稀释液，甘油浓度以1%-3%为宜。（三）冷冻精液的生产程序采精品质检查稀释前处理（猪要浓缩）稀释分装（细管或颗粒冻精）0-4℃平衡2-4h冷冻解冻、品质检查-80--110℃平衡4-5min装袋、管保存一、输精前的准备Preparations二、输精的基本要求Requirements三、输精方法Methods四、影响人工授精受胎率的因素FactorsinfluencingthefertilitybyAI第六节输精Section6Insemination一、输精前的准备输精器械的准备1精液的准备2母畜的准备输精人员准备234二、输精要求猪牛水牛山羊马精液类型液态冷冻冷冻液态液态输精量(ml)30-400.2-10.