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实验四革兰氏染色法一、目的要求了解革兰氏染色的原理，学习并掌握革兰氏染色的方法。二、基本原理革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。它是1884年由丹麦医师Gram创立的。革兰氏染色法（Gramstain）不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料（basicdye）初染液；媒染剂（mordant）；脱色剂（decolorisingagent）和复染液（counterstain）。碱性染料初染液的作用象在细菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫（crystalviolet）。媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，碘（iodine）是常用的媒染剂。脱色剂是将被染色的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95％的酒精（ethanol）。复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，从而将细胞区分成G+和G-两大类群，常用的复染液是番红。三、器材大肠杆菌，枯草芽孢杆菌；革兰氏染色液，载玻片，显微镜等。四、操作步骤1．涂片将培养14—16小时的枯草芽孢杆菌和培养24小时的大肠杆菌分别作涂片（注意涂片切不可过于浓厚），干燥、固定。固定时通过火焰1—2次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。2．染色（1）初染加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟，水洗。（2）媒染滴加碘液冲去残水，并覆盖约一分钟，水洗。（3）脱色将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景，用95％酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约20—30秒钟，立即用水冲净酒精。（4）复染用番红液染1—2分钟，水洗。（5）镜检干燥后，置油镜观察。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。（6）同法在一载玻片上以大肠杆菌与枯草芽孢杆菌混合制片，作革兰氏染色对比。革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌；而脱色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈阴性反应。五、实验报告1．结果在你所作的革兰氏染色制片中，大肠杆菌和枯草芽孢杆菌各染成何色？它们是革兰氏阴性菌还是革兰氏阳性菌？2．思考题（1）作革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚？其染色成败的关键一步是什么？（2）当你对一株未知菌进行革兰氏染色时，怎样能确证你的染色技术操作正确，结果可靠？附录：显微镜油镜的使用1、用低倍镜对光。2、低倍镜观察（寻找观察目标）。3、高倍镜观察（选取理想的观察目标）。4、油镜观察：高倍镜观察后----上升镜微--油镜转至正下方在载玻片上加一小滴香柏油--小心地下降镜微使镜头浸在油里----用粗螺旋将镜微缓慢上升，寻找目标（物象）----用螺旋调节，使物象清晰----观察记录。5、观察完毕。上升镜筒转动物镜转换器，使油镜物镜偏位。用干净擦镜纸擦去镜头上的油迹，最后再用擦镜纸擦去残留在镜头上的二甲苯。6、将显微镜各部分还原，放回箱中。思考：油镜完毕后，镜头应如何处理?