单克隆抗体制备主要步骤包括:动物免疫、细胞融合、杂交瘤细胞的筛选与单抗检测、杂交瘤细胞的克隆化、单抗的鉴定及制备等。1动物免疫根据抗原的特性选择合适的免疫方案,对于可溶性抗原免疫原性弱,一般要加佐剂。常用佐剂为福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂。要求抗原和佐剂等体积混合在一起,研磨成油包水的乳糜状。(1)初次免疫,Ag50ug/只,加福氏完全佐剂皮下多点注射,一般1.5ml,间隔3周。(2)第二次免疫,剂量途径同上,加福氏不完全佐剂,间隔3周。(3)第三次免疫,剂量同上,不加佐剂,腹腔注射,7天后采血测其效价,检测免疫效果,间隔3周。(4)加强免疫,剂量50ug,腹腔注射。(5)3天后,取脾融合。2细胞融合(1)饲养细胞的制备在细胞融合后选择性培养过程中,由于大量骨髓瘤细胞和脾细胞相继死亡,此时单个或少数分散的杂交瘤细胞多半不易存活,通常必须加入其他活细胞使之繁殖,这种被加入的活细胞称为饲养细胞小鼠腹腔巨噬细胞的准备:①用6-10周龄的BALB/c小鼠。②拉颈处死,浸泡于75%的酒精,消毒3min,用无菌剪刀剪开皮肤,暴露腹膜。用吸管注入6ml培养液,反复冲洗,吸出冲洗液。③放入10ml离心管,1200rpm离心5min.④用20%小牛血清的培养液混悬,调整细胞数为1*105/ml.加入96孔板,100ul/孔。放入37度孵箱培养。(2)骨髓瘤细胞的准备①于融合前48-36小时,将骨髓瘤细胞扩大培养②融合当天,用弯头滴管将细胞从瓶壁轻轻吹下,收集于50ml离心管或融合管内。③1000r/min离心5-10分钟,弃去上清。④加入30ml不完全培养基,离心洗涤一次。然后将细胞重悬浮于10ml不完全培养基,混匀。⑤取骨髓瘤细胞悬液,加0.4%台酚蓝染液作活细胞计数后备用。(3)脾细胞的准备取已经免疫的BALB/c小鼠,摘除眼球采血,并分离血清作为抗体检测时的阳性对照血清。同时通过颈脱位致死小鼠,浸泡于75%酒精中5分钟,于培养皿上固定后掀开左侧腹部皮肤,可看到脾脏,换眼科剪镊,在超净台中用无菌手术剪开腹膜,取出脾脏置于已盛有10ml不完全培养基的平皿中,轻轻洗涤,并细心剥去周围结缔组织。置平皿中不锈钢筛网上,用注射器针芯研磨成细胞悬液后计数。,使脾细胞进入平皿中的不完全培养基。用吸管吹打数次,制成单细胞悬液。通常每只小鼠1×108-2.5×108个脾细胞。(4)细胞融合①将1×108脾细胞与1×107骨髓瘤细胞SP2/0混合于一支50ml融合管中,补加不完全培养基至30ml,充分混匀。②1000r/min离心5-10分钟,将上清尽量吸净。③在手掌上轻击融合管底,使沉淀细胞松散均匀;④用1ml吸管在30s内加入预热的50%PEG1ml,边加边轻轻搅拌。⑤吸入吸管静置1min。⑥加入预热的不完全培养液,终止PEG作用,连续每2min内分别加入1ml,2ml,3ml,4ml,5ml,10ml.⑦800rpm,5分钟;弃去上清。⑧加入5ml完全培养基,轻轻吹吸沉淀细胞,使其悬浮并混匀,然后补加完全培养基至40-50ml。分装96孔细胞培养板,每孔100ul,然后将培养板置37℃,5%CO2培养箱内培养。⑨6h后补加选择培养基。每孔50ul.3天后用选择培养基半换液。⑩.经常观察杂交瘤细胞生长情况,待其长至孔底面积1/10以上时吸出上清供抗体检测。(5)杂交瘤细胞的选择①抗原用包被液稀释至10ug/ml。②以100ul/孔量加入酶标板孔中,置4℃过夜或37℃吸附2小时。③弃去孔内的液体,同时用洗涤液洗3次,每次3分钟,拍干。④每孔加100ul封闭液37℃封闭1小时;⑤洗涤液洗3次;⑥每孔加100ul待检杂交瘤细胞培养上清,同时设立阳性、阴性对照和空白对照;37℃孵育1小时;洗涤,拍干。⑦加酶标第二抗体,每孔100ul,37℃孵育1小时,洗涤,拍干。⑧加底物液,每孔加新鲜配制的底物使用液100ul,37℃20分钟。⑨以2mol/LH2SO4终止反应,在酶联免疫阅读仪上读取OD值。⑩结果判定:以P/N≧2.1,或P≧N+3SD为阳性。若阴性对照孔无色或接近无色,阳性对照孔明确显色,则可直接用肉眼观察结果(6)杂交瘤细胞的克隆化(有限稀释法)①制备小鼠脾细胞为饲养细胞。②制备待克隆的杂交瘤细胞悬液,用含20%血清的HT培养基稀释至每毫升含5、10和20个细胞3种不同的稀释度。③按每毫升加入5×104-1×105细胞的比例,在上述杂交瘤细胞悬液中分别加入腹腔巨噬细胞。④每种杂交瘤细胞分装96孔板一块,每孔量为100ul.⑤37℃、5%CO2培养6天,出现肉眼可见的克隆即可检测抗体;在倒置显微镜下观察,标出只有单个克隆生长的孔,取上清作抗体检测。⑥取抗体检测阳性孔的细胞扩大培养,并冻存。3单克隆抗体的Ig类与亚类的鉴定①以10ug/ml浓度的抗原包被酶标板,50ul/孔,4℃过夜。②洗涤后,加入待检的单抗样品,100ul/孔,37℃1小时;设阴性、阳性对照孔。③洗涤后,加入HRP标记的抗小鼠类及亚类Ig的抗体试剂,100ul/孔,37℃避光显色20分钟;用2mol/LH2SO4终止反应后,根据颜色判断抗体的亚型。4单克隆抗体的生产及纯化(1)动物体内生产单抗①成年BALB/c小鼠腹腔接种降植烷或液体石蜡,每只小鼠0.3-0.5ml。②7-10天后腹腔接种用PBS或无血清培养基稀释的杂交瘤细胞,每只小鼠5×105/0.2ml。③间隔5天后,每天观察小鼠腹水产生情况,如腹部明显膨大,以手触摸时,皮肤有紧张感,即可采集腹水。通常每只小鼠可采3ml腹水;④将腹水离心(2000r/min5分钟),除去细胞成分和其他的沉淀物,收集上清,测定抗体效价,分装,-70℃冻存备用。(2)单克隆抗体的纯化(辛酸-硫酸铵沉淀法)①腹水4℃12000rpm离心15min,去除杂质。②取1份腹水加2份0.06mol/LPH5.0醋酸缓冲液,按每毫升稀释腹水加33ul辛酸的比例,室温搅拌下逐滴加入辛酸,室温混合30min③4℃静置2小时,取出12000g离心30分钟,弃沉淀;④上清经尼龙筛过滤,于50倍体积的0.01MPH7.4PBS中4℃透析6h.⑤在透析后的上清中加入等体积饱和硫酸铵溶液。⑥4℃静置1h以上,10000g离心30分钟,弃上清。⑦沉淀溶于适量PBS(含137mmol/LNaCl,2.6mol/LKCl,0.2mmol/LEDTA)中,于50-100倍体积的PBS中透析过夜。⑧取少量透析后样品适当稀释后,以紫外分光光度计检测蛋白含量,SDS-PAGE,WB检测抗体纯度。