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课题3血红蛋白的提取和分离血红蛋白只存在于红细胞内，含有四条肽链,每条肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳，血红蛋白因含有血红素而呈红色。血红蛋白两个α－肽链两个β一肽链四个亚铁红素基团血红蛋白的特点：一、基础知识:【思考1】:1、分离生物大分子的基本思路是什么？2、不同蛋白质的特性在哪些方面存在差异？3、本课题我们将利用血红蛋白与杂质蛋白哪方面的差异进行提纯？4、为什么不用鸡的血红细胞而用哺乳动物的血红细胞作为实验材料？5、用什么方法分离相对分子质量不同的蛋白质？一、基础知识--蛋白质提取和分离原理蛋白质提取与分离的依据－－蛋白质的物理化学性质：形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、亲和力等千差万别。提取分离方法凝胶色谱法凝胶电泳法1、原理：2、材料-小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢。大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；多孔性的多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。凝胶(一)凝胶色谱法（分配色谱法）：根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法分子量大小直径大小运动方式运动速度运动路径洗脱次序一、基础知识---蛋白质分离和提取的原理大于凝胶颗粒孔隙直径，被阻挡在颗粒的外面小于凝胶颗粒孔隙直径，可以进入颗粒内部垂直向下移动垂直向下移动，无规则扩散进入颗粒内部较快较慢较短较长先从凝胶柱洗脱出来后从凝胶柱洗脱出来3、具体过程一、基础知识---蛋白质分离和提取的原理凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示1、什么是缓冲液？2、缓冲液的作用是什么？【思考2】:（二）、缓冲溶液-在一定的范围内，凡是能够抵制外加少量强酸或强碱的影响使原来溶液PH值基本保持不变的混合溶液。由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成。如H2CO3/NaHCO3，醋酸/醋酸钠，NaH2PO4/Na2HPO4等能够抵制外界的酸和碱对溶液PH值的影响，维持PH基本不变。洗脱剂3、缓冲液是如何配制的？4、本实验加的是什么缓冲液？为何要加缓冲液？通常由1－2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同pH范围内使用的缓冲液。磷酸缓冲液在本课题中使用的缓冲液是:__________,其目的是:利用缓冲液模拟细胞内的pH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察(红色)和科学研究(活性)2.原理：(三)电泳1.电泳的概念指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程.①许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团会带上正电或负电。②在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。③电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。凝胶电泳原理示意图在一定pH下，使蛋白质基团带上正电或负电；加入带负电荷多的SDS，形成“蛋白质－SDS复合物”，使蛋白质迁移速率完全取决于分子大小。(三)电泳3.类型:琼脂糖凝胶电泳、聚丙稀酰胺凝胶电泳。4.聚丙稀酰胺凝胶电泳分离过程：二、实验操作蛋白质的提取和分离一般分为四步：（1）样品处理：包括洗涤红细胞；血红蛋白释放；离心分离等操作收集到的血红蛋白溶液。（2）粗分离：透析除去分子较小的杂质。（3）纯化：通过凝胶色谱法将分子量较大的杂质蛋白质除去。（4）纯度鉴定：通过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。↓↓↓（一）样品处理血液血浆水分固体物质：血浆蛋白、无机盐、磷脂、葡萄糖等血细胞白细胞血小板红细胞（最多）血红蛋白（90％）两个α－肽链两个β一肽链四个亚铁红素基团血液的成分（一）样品处理及粗分离1、红细胞的洗涤：（2）目的是去除杂蛋白。要加入柠檬酸钠防止血液凝固血液＋柠檬酸钠→低速短时离心→吸出上层血浆→红细胞＋5倍体积生理盐水→缓慢搅拌10min→低速短时离心→吸出上清液→反复洗涤直至上清液无黄色（1）步骤：柜式离心机初次离心后的结果3次洗涤后的结果在蒸馏水和甲苯作用下搅拌，红细胞破裂释放2、血红蛋白的释放：蒸馏水的作用是加入甲苯的作用是充分搅拌的目的是使红细胞大量吸水胀裂溶解红细胞的细胞膜加速红细胞的破裂搅拌器转子磁力搅拌器搅拌器正在工作3.分离血红蛋白分离过程红细胞混合液中速离心10min离心管滤纸过滤脂类物质烧杯红细胞破碎混合液→中速长时离心（2000r/min×10min）→滤纸过滤除去脂质→分液漏斗分离出血红蛋白，得到红色透明液体。分离血红蛋白溶液有机溶剂无色透明的甲苯层脂类物质白色脂溶性物质沉淀层血红蛋白溶液红色透明液体红细胞破碎物沉淀暗红色沉淀物20mmol/L磷酸缓冲液1mL1mL4、透析（粗提取）：装入透析袋并置于磷酸缓冲液中（PH为7.0）透析。利用透析袋透析透析过程（二）纯化－－凝胶色谱操作1.凝胶色谱柱的制作：2.凝胶色谱柱的装填：3.样品的加入和洗脱（二）凝胶色谱操作1、凝胶色谱柱的制作：①取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。②底塞的制作：打孔→挖出凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端。③顶塞的制作：打孔→安装玻璃管。④组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。⑤安装其他附属结构。如P68图5-19注意事项：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。材料：交联葡聚糖凝胶G-75；20mmol/L磷酸缓冲液装填:2.凝胶色谱柱的装填：步骤操作要求①②③④⑤立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h洗涤平衡一次性缓慢倒入；轻轻敲打装填悬浮液凝胶颗粒＋洗脱液→沸水浴凝胶颗粒＋蒸馏水→充分溶胀根据色谱柱体积计算凝胶用量色谱柱垂直固定在支架上配制悬浮液计算称量凝胶固定色谱柱注意：1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。3、洗脱液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。4、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。装配好的凝胶柱如图5-213.样品加入与洗脱①调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。②滴加透析样品：吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。③样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。④洗脱：小心加入pH=7.0的20mmol/l的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。⑤收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5ml收集一试管，连续收集。（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）⑥注意：正确的加样操作：1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。3.样品的加入和洗脱开始进行层析收集得到的纯化后的蛋白知识总结血红蛋白的提取和分离蛋白质分子的差异性凝胶色谱法原理分离过程凝胶电泳法缓冲溶液组成作用蛋白质的提取分离样品处理粗分离纯化纯度鉴定教学反馈1．凝胶色谱法是根据（）分离蛋白质的有效方法。A分子的大小B相对分子质量的大小C带电荷的多少D溶解度2．缓冲液的作用是：在一定范围内，抵制外界的影响来维持（）基本不变。A温度BpHC渗透压D氧气浓度BB3．电泳是指带电粒子在电场的作用下向着与其所带电荷（）的电极移动。A相同B相反C相对D相向4.哺乳动物和人的成熟的红细胞中的（）与氧气的运输有关。A血红蛋白B肌红蛋白C肌动蛋白D肌球蛋白BA5．血液由血浆和各种血细胞组成，其中（）的含量最多。A白细胞B血小板C红细胞D淋巴细胞6．为防止血液凝固，在采血容器中要预先加入抗凝血剂（）。A.NaClB.甲苯C.蒸馏水D.柠檬酸钠CD7．将搅拌好的混合液转移到离心管中，离心后，可以明显看到试管中的溶液分为4层，其中第3层是（）A无色透明的甲苯层B脂溶性物质的沉淀层C血红蛋白的水溶液D其他杂质的暗红色沉淀物C1、随着人类跨入蛋白质组时代，对蛋白质的研究和应用越来越深入，首先要做的一步是A弄清各种蛋白质的空间结构B弄清各种蛋白质的功能C弄清各种蛋白质的合成过程D获得高纯度的蛋白质练习巩固2、用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中，关于蛋白质的叙述，正确的是A相对分子质量较小的蛋白质行程大于相对分子质量较大的蛋白质B相对分子质量较小的蛋白质行程小于相对分子质量较大的蛋白质C相对分子质量较小的蛋白质行程等于相对分子质量较大的蛋白质D二者根本无法比较3、使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于A电荷的多少B分子的大小C肽链的多少D分子形状的差异4、在采血容器中加入柠檬酸钠的目的是A调节pHB维持红细胞的能量供应C防止微生物生长D防止血液凝固梦想的力量当我充满自信地，朝着梦想的方向迈进并且毫不畏惧地，过着我理想中的生活成功，会在不期然间忽然降临！1、聪明出于勤奋，天才在于积累。2、三更灯火五更鸡，正是男儿读书时。黑发不知勤学早，白首方悔读书迟。3、鸟欲高飞先振翅，人求上进先读书。4、勤学如春起之苗，不见其增，日有所长；辍学如磨刀之石，不见其损，日有所亏。