研究生实验三-重组质粒DNA提取、双酶切鉴定

质粒DNA的制备限制性内切酶切割重组质粒朱文博中山医学院基因克隆•定义：经无性繁殖获得基因许多相同拷贝的过程。通常是将单个基因导入宿主细胞中复制而成。基因工程•定义：实现基因克隆所采用的方法及相关的工作统称为基因工程，又称重组DNA技术。•基因克隆示意图载体DNA(限制性内切酶切开)目的基因＋宿主细胞＋重组体已转化的宿主细胞阳性克隆株繁殖表达分、切接转筛基因载体基因工程中常用的载体(vector)主要包括质粒(plasmid)、噬菌体(phage)和病毒(virus)柯斯质粒。这些载体均需经人工构建，除去致病基因，并赋予一些新的功能，如有利于进行筛选的标志基因、单一的限制酶切点等。实验内容2.限制性内切酶的酶切鉴定(P82)3.定性鉴定:DNA的琼脂糖凝胶电泳4.定量检测：DNA的紫外分光光度法测定(P39)1.质粒DNA的提取与纯化(P70碱法)实验目的掌握碱裂解法抽提质粒的原理、步骤及各试剂的作用;掌握核酸内切酶切割质粒的原理并学会运用内切酶一.质粒DNA的提取1关于质粒的概念a.什么是质粒（plasmid）？b.质粒的本质是什么？c.质粒有哪些构型？c.质粒有哪些特点？d.质粒的用途有哪些？81.1质粒的定义质粒是细菌细胞内一种自我复制的环状双链DNA分子，能稳定地独立存在于染色体外，并传递到子代，一般不整合到宿主染色体上。在细胞内它们常以共价闭环的超螺旋形式存在。9(1)超螺旋DNA(supercoiledDNA,SCDNA)1.2质粒的三种构型10(2)开环DNA(opencircularDNA,OCDNA)如果两条链中有一条的一处或多处断裂，分子就能发生旋转而消除链的张力，形成松弛型的环状分子。11(3)线状DNA(linearDNA,LDNA):如果两条链均断开，即为线状DNA。电泳时，三者泳动速度大小关系（？？？）12最快中最慢1.3质粒DNA的基本特征：(1)自主复制性：能独立于染色体DNA外自主复制；(2)可扩增性：严紧型复制-复制1-5个拷贝松弛型复制-复制数十个拷贝；(3)可转移性：通过细菌结合作用从一个宿主细胞转移到另一个宿主细胞；(4)不相容性：具有相似复制子结构特征的两种不同质粒不能稳定地存在于同一受体细胞内。14151.4理想的克隆载体：(1)分子质量小、多拷贝、松弛控制型；(2)具有多种常用的限制酶的单切点；(3)能插入较大的外源DNA片段；(4)具有容易操作的检测表型。151.4提取质粒DNA的目的与意义：基因载体/基因克隆/基因工程2.1提取质粒DNA的常规方法(1)SDS碱裂解法(2)煮沸法(3)highpureplasmidisolationkit等。但原理相似，都是利用宿主染色体DNA和质粒DNA的差异来分离的：★宿主菌染色体DNA通常比质粒DNA要大得多★纯化分离的宿主菌DNA多为线性分子，而质粒DNA呈闭合环的形式。2提取大肠杆菌质粒DNA的方法和原则2.2分离纯化质粒DNA的主要步骤(1)培养细菌使质粒扩增（DNA的扩增与选择）(2)细菌的收集与裂解•收集方法：高速离心的方法•裂解细菌方法：去污剂法、有机溶剂法、碱变性法、沸水热裂法、溶菌酶法、超声处理法等。根据质粒的大小、宿主菌菌株及裂解后的纯化方法等因素综合后加以选择。(3)质粒DNA的纯化•常用的方法有：超速离心、层析法、聚乙二醇沉淀法等所有纯化方法都是利用了质粒DNA相对较小及共价闭合环状的性质。2.3核酸分离纯化的总原则：•(1)保证核酸一级结构完整•(2)排除其他分子的污染（蛋白质、脂类、糖、有机溶剂、金属离子、其他DNA、RNA等）3.SDS-碱裂解法提取Puc119-U6重组质粒DNA3.1实验原理：高碱细菌的细胞壁破裂，内容物释放①染色体DNA断裂成不同长度的线性双链DNA；②线性双链DNA片段中的氢键断裂，双链解离变性。①质粒DNA不发生断裂，保持双链闭合环状；②双链DNA并不完全分离。高酸中和至中性变性的染色体DNA与变性的蛋白质以及细胞碎片凝聚成网络状大分子不溶性沉淀物质粒DNA又恢复天然构型，溶解在上清液中纯化RNA酶消化除去RNA，并用酚抽提法除去残留的蛋白质3.2主要试剂及作用溶液Ⅰ：由葡萄糖、EDTA、Tris•HCl组成.(保护、缓冲)①葡萄糖的作用是增加溶液的粘度,减少抽提过程中的机械剪切作用,防止破坏质粒.(保护作用)②EDTA的作用是络合掉镁等二价金属离子,防止DNA酶对质粒分子的降解作用。（保护作用）③Tris•HCl能使溶菌液维持溶菌作用的最适PH范围（缓冲作用）21溶液II：由SDS（十二烷基硫酸钠）与NaOH组成(裂解、变性)①SDS的作用是解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之变性（裂解细胞和蛋白质变性作用）②NaOH（PH12）的作用是破坏氢键，使DNA分子变性（DNA变性作用）22溶液III：HAC(乙酸)和KAC(乙酸钾)组成的高盐溶液(复性，分离)①HAC溶液能中和溶液Ⅱ的碱性，使染色体DNA变性而发生缠绕，并使质粒DNA复性。②KAC会与SDS形成溶解度很低的盐，并与蛋白质形成沉淀而除去；溶液中的DNA也会与蛋白质-SDS复合物缠绕成大分子而与小分子质粒DNA分离。3.3实验步骤加1.4ml培养物于1.5mlEP管，12000rpm×1min，去上清，加入冰的200µl溶液I(保护溶液)，剧烈振荡EP管重悬细菌，室温放置3min加入200µl溶液II(高碱)，快速颠倒数次，冰浴3min(不要剧烈振荡！)加入150µl冰溶液III(高酸)，温和振荡10s，冰浴5min，12000rpm×5min转移上清500µl到新EP管，加入等体积500µl的酚与氯仿/异戊醇的混合物(1:1混合)，充分颠倒混匀，12000rpm×5min400µl上层水相转移到新的EP管，加入等体积400µl氯仿/异戊醇，颠倒混匀，12000rpm5min400µl上层水相转移到新的EP管，加入2倍体积800µl无水乙醇，颠倒混匀，-20℃冰箱中放置15min，12000rpm10min弃上清，沉淀中加1ml70%乙醇，颠倒混匀，12000rpm×5min去上清，管平放室温静风干，20µlTE溶解DNA，其中10µl加入酶切反应管，置于PCR仪37度反应2h，余10µl置于-20度冰箱保存二、限制性内切酶切割重组质粒1关于限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease）1.1定义能识别DNA的特意序列（酶切位点），并在此位点或周围催化双链DNA分子的断裂,产生相应的限制性DNA片段。主要存在于细菌体内。切割不同来源的DNA分子将产生特征性限制性酶切图谱，具有重大应用价值（“分子手术刀”）。251.3作用与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA。1.2分类Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技术中常用Ⅱ型）第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。1.4命名HindⅢ属系株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血杆菌d株的第三种酶2BamHI、HindⅢ酶切质粒及鉴定2.1实验原理：利用限制性内切酶特异的识别DNA特异的核苷酸序列，并切割DNA,产生一定长度的DNA片段，通过电泳对酶切前后产物分析可以鉴别目的基因（重组质粒DNA）28重组质粒（PUC119-U6）BamHIHindIII双酶切电泳检测5'-GAATTC-3‘3'-CTTAAG-5'BamHI5'-AAGCTT-3'3'-TTCGAA-5'HindIIIPUC119（3.2Kb）U6启动子（256bp）2.2实验材料:(1)重组质粒;(2)BamHI、HindⅢ限制性内切酶;(3)反应缓冲液。312.3实验步骤(1)建立反应体系(2)酶切反应（温育12h）(3)电泳鉴定（下次实验课内容）322.4双酶切体系质粒DNA10μl10×Mbuffer2μlBamHⅠ1μlHindⅢ1μlddH2O6μl33合计20μl准备室老师已加好同学自己加实验步骤：将10μl质粒DNA加入已装有反应缓冲液的0.2mlEP管，置于已调成37℃的PCR仪反应2h；余下10μlDNA保存于-20℃冰箱待做转化与筛选实验。思考题？•为什么要用双酶切而不是单酶切割重组质粒DNA？34