填料的选择

GEHealthcare凝胶基础知识培训2/GE/Resolution:dependsonefficiencyandselectivityHighefficiencyLowefficiencyHighselectivityLowerselectivityEfficiency:评估峰的宽窄高效意味着峰窄高效意味着柱子装的好高效可以弥补低选择性带来的不利Selectivity:评估峰的分开程度的高选择性意味着两个峰从基线分开假如选择性较高，低有效性可以接受(前提是峰体积增大能接受).3/GE/如何选择凝胶？•五大类层析方法-1.凝胶过滤(GC)2.离子交换(IEX)3.亲和层析(AC)4.疏水层析(HIC)5.反相层析(RPC)4/GE/介质的普遍性质介质-颗粒越细、大小越均匀，分辨率越高，但反压亦较高(SOURCE介质例外)，HP代表细颗粒，FF代表高流速，XL代表高载量。BigBeads物理稳定性-新一代介质较坚固，能承受高流速，同时保持柱床体积和结构稳定，省却每次重新装柱，提高重复性化学稳定性-新一代介质能承受极端pH，高盐度，促溶剂和有机溶剂，利于开发分离条件和在位清洗(CIP)，大大延长介质寿命和提高重复性5/GE/BioProcess凝胶特别适合生产应用,特点包括：•高重复性：适用于任何规模的工艺放大•高物理、化学稳定性：易于清洗、消毒及再生、介质寿命特长•高动力载量、流速快：缩短生产周期和次数，节省凝胶用量(尤其XL介质，载量可比普通介质高达10倍！)•每种凝胶均有完整的文献、档案和RegulatorySupportFile6/GE/融合蛋白质非融合蛋白质表达简单纯化一步亲和层析90-97%纯度三步纯化策略粗提中度纯化精细纯化多步纯化蛋白质纯化策略7/GE/适用於三步纯化策略的层析技术层析技术主要特色粗提中度纯化精细纯化IEX高分辨率高载量快速HIC分辨率好载量一般快速AC高分辨率高载量快速GF高分辨率RPC高分辨率8/GE/目的纯化粗样快速浓缩(减少体积)和稳定样品(去除蛋白酶)最适用层析技术:离子交换/疏水层析分辩率快速回收率载量粗提9/GE/粗提:离子交换填料预装柱20ml颗粒大小流速HiPrep™16/10QXL&SPXL90µm10ml/minHiPrep16/10DEAE&CM90µm10ml/minSepharose™BigBeadsSepharose™FastFlowSepharose™XL10/GE/粗提:疏水层析填料HiPrep™16/10HiTrap™HIC选择试剂盒SepharoseFFPhenyl(苯基)Butyl（丁基）Octyl(辛基）11/GE/中度纯化目的去除大部分杂质最适用层析技术:离子交换/疏水层析分辩率快速回收率载量12/GE/中度纯化:离子交换填料Sepharose™HP34µmQ&SP150cm/hr小包装和预装柱交联琼脂醣SOURCE™30µmSepharoseHighPerformanceSOURCE30Q&S1800cm/hr聚苯乙烯/二乙烯基苯小包装13/GE/中度纯化:疏水层析填料Sepharose™HP34µm苯基，丁基，异丙基300cm/hr小包装和预装柱14/GE/回收率载量目的达到最终纯度(去除聚合物,结构变异物)最适用层析技术:凝胶过滤/离子交换/疏水层析/反相层析分辩率速度精细纯化15/GE/精细纯化:凝胶过滤填料Superdex™PeptideSuperdex200Superdex75分离分子量大小(球状蛋白质)102103104105106PrepGrade(34µm）GL(13µm)有HiLoad™预装柱和小包装填料Mr100-7000Mr3000-70000Mr10000-60000016/GE/Mono™BeadsQ&S10µm:MonoQ&S25mg上样载量3µm:MiniQ&SMini™BeadsQ&S2mg上样载量精细纯化:离子交换填料17/GE/MiniQ和MiniS离子交换柱(3mm)高分辨Sample:dA12-dA30mixtureBufferA:10mMNaOHBufferB:10mMNaOH,2MNaClFlowrate:1.0ml/minMiniQPE4.6/50用少於15min分离12-30碱基的dA寡核酸18/GE/精细纯化:疏水层析填料RESOURCE™Phenyl苯基Isopropyl异丙基Ether乙醚1ml预装柱流速高达10ml/minRESOURCEHICTestKit19/GE/精细纯化:反相层析填料Sephasil™µRPCSOURCE™RPC硅胶3µmC2/C18聚苯乙烯/二乙烯基苯120Å:肽类C4,C8,C185and12µm硅胶100Å:肽类300Å:蛋白质pH1-12(14)肽类5,15and30µm20/GE/凝胶过滤介质•以分子量大小作分离，大分子先走完柱子，小分子后出；不同介质有不同分离范围，须根据目标物的大小而作选择JBGF1998-06-0421GelstructureAGAROSEAgoodgelforgelfiltrationcontainsabout95%water21/GE/凝胶过滤种类SephadexSepharoseSephacrylSuperdexSuperose22/GE/SephadexSephadex是由葡聚糖交联异表氯醇形成的多孔结构GeltypeDrybeadsizeumFractionationrangeGlobularproteinsFractionrangeDextransSwellingfactorml/gSephadexG-1040-120smallerthan700-7002-3SephadexG-1540-120100-1500-15002.5-3.5SephadexG-25Coarse100-3001000-5000100-50004-6SephadexG-25Medium50-1501000-5000100-50004-6SephadexG-25Fine20-801000-5000100-50004-6SephadexG-25Superfine10-401000-5000100-50004-6SephadexG-50Coarse100-3001500-30000500-100009-11SephadexG-50Mediun50-1501500-30000500-100009-11SephadexG-50Fine20-801500-30000500-100009-11SephadexG-50Superfine10-401500-30000500-100009-11SephadexG-7540-1203000-800001000-5000012-15SephadexG-75Superfine10-403000-700001000-5000012-15SephadexG-10040-1204000-1500001000-10000015-20SephadexG-100Superfine10-404000-1000001000-10000015-20SephadexG-15040-1205000-3000001000-15000020-30SephadexG-150Superfine10-405000-1500001000-15000018-22SephadexG-20040-1205000-6000001000-20000030-40SephadexG-200Superfine10-405000-2500001000-15000020-25PropertiesofSephadex•Sephadex以渐被以上的BioProcess介质所代替，除了SephadexG-25在工业上用作去盐和交换缓冲液，也有预装了的易用的HiTrapDesalting柱和FastDesaltingColumnHR10/1023/GE/SepharoseSepharose是由琼脂糖交联形成的多孔结构。使用pH范围4-9，使用温度范围4-40℃。短期可使用Gu.HCl和Urea等变性剂，不能使用chaotropicsalt如KSCN等。长期使用Gu.HCl和Urea等变性剂或使用chaotropicsalt时，应选择Sepharose-Cl系列。Sepharose-Cl系列是Sepharose是在碱性条件下结合2.3-二溴丙醇，增强了Sepharose的物理化学稳定性，特别适合含有机溶剂的分离，能承受较强的在位清洗，并可高温消毒。GeltypeApprox.%agaroseBeadsizeumFractionationrangeGlobularproteinsFractionationrangeDextransSepharose6B645-16510000-400000010000-1000000Sepharose4B445-16560000-2000000030000-5000000Sepharose2B260-20070000-40000000100000-2000000PropertiesofSepharose•甚至可分DNA，Sepharose4and6FastFlow是高度偶联的琼脂糖介质，因此大大加强了机械性能，流速特快(200cm/hr)，非特异性吸附极低，适合工业规模生产。24/GE/SephacrylSephacryl是葡聚糖交联Ｎ,Ｎ－亚甲基二乙酰胺形成的。具有良好的机械性能，比传统的Sephadex化学稳定性高。可用０.５ＭNaOH进行清洗。短期可使用有机溶剂，并可在121℃灭菌。也可使用变性剂。GeltypeBeadsizeFractionationrangeGlobularproteinsFractionationrangeDextransExclusionlimitDNASephacrylS-100HR25-75um1000-100000NDNDSephacrylS-200HR25-75um5000-2500001000-80000118SephacrylS-300HR25-75um10000-15000002000-400000118SephacrylS-400HR25-75um20000-800000010000-2000000271SephacrylS-500HR25-75umND40000-200000001078PropertiesofSephacrylHR•Sephacryl有6种不同分离范围，提供广阔的选择性，甚至可分DNA质粒和病毒，经济、高效，反压低，易于自行装柱，是Superdex外作下游纯化的理想介质25/GE/SuperoseSuperose是由高度交联的琼脂糖形成的多孔球形结构。根椐颗粒大小分为两类：操作pH为3-12，清洗时pH为1-14。如0.2M的NaOH和0.01M的HCl以及1M的乙酸。清洗时可用0.5M的NaOH和0.5M的HCl。同时，也可使用1%的SDS，8M的Urea和6M的Gu.Cl。可在pH7，121℃灭菌30Min。GeltypeBeadsizeumFractionationrangeGlobularproteinspHrangeSuperose12prepgrade20-401000-3000003-12Superose128-121000-3000003-12Superose6prepgrade20-405000-50000003-12Superose611-155000-50000003-12PropertiesofSuperoseSuperose6,12预装柱(HR10/30,13um)有宽广的分离范围配合高分辨率，优化条件可在Superose6,12PrepGrade(20-40um)直接放大26/GE/SuperdexSuperdex是由高度交联的结合有葡聚糖的琼脂糖形成的多孔结构。具有低吸附，化学物理稳定性高，可0.1MHCl,０.５MNacl进