3.2月季的花药培养-(1).

3.2月季的花药培养一、被子植物的花粉发育1、被子植物子房胚珠一、被子植物的花粉发育1、被子植物凡是种子有果皮包被着，胚珠有子房壁包被着的植物，就叫做被子植物花的结构一、被子植物的花粉发育一、被子植物的花粉发育小孢子母细胞4个小孢子四分体时期1个小孢子单核居中期1个小孢子单核靠边期花粉粒双核期一、被子植物的花粉发育雄蕊：花丝花药：囊状结构，内有很多花粉粒花粉是小孢子母细胞经过减数分裂而形成的，因此，花粉是单倍体的生殖细胞。花粉的发育要经历：四分体时期、单核期、双核期花粉发育过程减数分裂有丝分裂小孢子母细胞花粉母细胞小孢子减数分裂_____分裂花粉管细胞核生殖细胞核____分裂__个精子1个营养细胞生殖细胞4个4个4个4个4个8个（小孢子四分体时期单核居中期单核靠边期双核期）两个精子和一个营养核的基因型相同?2有丝有丝注意：①二核花粉粒：成熟的花粉粒中，只含花粉管细胞核和生殖细胞核。（精子在花粉管中形成）②三核花粉粒：有些植物的花粉，在成熟前，生殖细胞进行一次有丝分裂，形成两个精子，这样的花粉在成熟时，含有一个营养核和两个精子。③两个精子和一个营养核的基因型相同。④1花粉母细胞4个小孢子减分有分4个花粉管细胞核4个生殖细胞核有分8个精子花雄蕊雌蕊花药花粉粒精子精子子房胚珠胚囊子房壁珠被卵细胞两个极核受精卵受精极核胚胚乳种皮种子果皮果实有丝分裂有丝分裂1n1n2n1n3n2n2n2n2n胚是一个新个体的幼体发育结果练习：①写出花粉的发育过程的发育过程（学生板书）②假如一种生物体细胞有２０条染色那么它的小孢子母细胞、小孢子、花粉管细胞核、生殖细胞核各有多少条染色体？如果小孢子母细胞的基因型为AａBｂ（两对基因位于两对同源染色体上）那么小孢子、花粉管细胞核和生殖细胞核的基因型是什么？答案：小孢子母细胞→４个小孢子→单核居中期→单核靠边期→花粉粒答案：２０、１０、１０、１０，AB或Aｂ或ａB或ａｂ。无论哪一种，来源于同一个小孢子的花粉管和生殖核的基因一定相同二、产生花粉植株的两种途径花药胚状体丛芽分化生根植物体诱导脱分化移栽胚状体:在组织培养过程中，某些体细胞在形态上转变为与合子发育成的胚非常相似的结构，发育过程亦与合子胚类似，胚芽、胚根、胚轴等结构完整,就像一颗种子。科学家将这种结构称为胚状体(体细胞胚)。基本概念：二、产生花粉植株的两种途径花药分化生根移栽诱导脱分化愈伤组织丛芽植物体愈伤组织：在人工培养基上由外植体长出来的一团无序生长的薄壁细胞（细胞排列疏松、无规则）。（二）产生花粉植株的两种途径形成原因：主要取决于培养基中的激素的种类及其浓度的配比1.为什么胚状体和愈伤组织到丛芽分别称为分化和再分化？思考2.花粉植株弱小，高度不育，是否就没有利用价值？用于单倍体育种技术，可明显缩短育种周期，培育纯合新品种。胚状体就像种子，有胚芽、胚轴、胚根等结构。胚状体到丛芽就是由原始的分化状态继续生长和分化完成的。而愈伤组织形成丛芽的过程是从脱分化状态进入再分化形成丛芽的过程。1、材料的选择2、培养基的组成（MS培养基+不同比例的激素）3、亲本植株的生长条件、材料的低温预处理以及接种密度等对诱导成功率都有一定影响三、影响花药培养的因素（三）影响花药培养的因素a.材料选择什么时期最好，为什么？b.如何选择单核期细胞？c.还有哪些影响花药培养的因素？阅读P38-39思考：诱导花粉植株能否成功及成功率的高低，主要影响因素是和。培养基的组成材料的选择花期为初花期，花粉发育在单核靠边期，成功率最高。选择完全未开放的花蕾亲本植株的生长条件、材料的预处理及接种密度等。1.不选择单核期之前花药原因：2.不选择单核期之后花药原因3.选择完全未开放花蕾的原因花药质地幼嫩，容易破碎花瓣开始松动，给材料消毒带来困难困难完全未开放的花蕾，可挑选到单核期的花药，菌少、易消毒2、培养基的组成花药培养所采用的培养基各成分中植物生长调节剂的水平和配比起决定作用。⑴诱导愈伤组织或胚状体产生的培养基：广泛使用2，4-D、IAA和KT；⑵诱导分化的培养基常除去2，4-D而以IBA或BA等代之。3、其他因素：材料的低温处理、接种密度、培养的环境条件等对诱导的成功率都有一定的影响。实验操作一、材料的选取二、材料的消毒三、接种和培养（一）材料选取2、通过镜检来确定是否处于适宜的发育期。方法：醋酸洋红法(将染色体染成___色)焙花青-铬矾法(花粉细胞核染成____色)。1、从花药看：月季的初花期从花粉看：单核期从花蕾看：完全未开放的花药（载玻片上）→1%的醋酸洋红1滴→用镊柄将花药捣碎，盖上盖玻片→镜检（花粉粒的细胞核被染成红色）花药（在卡诺氏固定液中处理20min）→取出，置于载玻片上→焙花青－铬矾溶液染色→盖上盖玻片→镜检（花粉粒的细胞核被染成蓝黑色）红蓝黑（二）材料的消毒（无菌吸水纸）吸干水分（0.1％氯化汞溶液）2～4min（无菌水）冲洗花蕾（70％酒精）大约30s（无菌水）清洗1.与菊花外植体的消毒相比较，有何不同？为什么？在酒精消毒前，花药不需要预先用流水冲洗、洗衣粉洗涤和软刷刷洗。因为月季花蕾外面有花萼、花瓣或颖片保护，通常处于无菌状态，所以只要将整个花蕾或幼穗消毒即可。2.为什么花瓣松动会给消毒带来困难？花瓣松动后，微生物就可能侵入到花药，给材料的消毒带来困难。（二）材料的消毒（无菌吸水纸）吸干水分（0.1％氯化汞溶液）2～4min（无菌水）冲洗花蕾（70％酒精）大约30s（无菌水）清洗1.与菊花外植体的消毒相比较，有何不同？为什么？在酒精消毒前，花药不需要预先用流水冲洗、洗衣粉洗涤和软刷刷洗。因为月季花蕾外面有花萼、花瓣或颖片保护，通常处于无菌状态，所以只要将整个花蕾或幼穗消毒即可。2.为什么花瓣松动会给消毒带来困难？花瓣松动后，微生物就可能侵入到花药，给材料的消毒带来困难。（三）接种和培养1灭菌后花蕾，要在下除去萼片和花瓣，并立即将花药接种到培养基上。3通常每瓶接种花药，温度控制在左右，。幼小植株形成后才。2在剥离花药时，要尽量（否则接种后，容易从受伤部位产生二倍体的愈伤组织），同时还要彻底，因为与花丝相连的花药不利于愈伤组织或胚状体的形成。一般经过20-30天培养后，会发现花药开裂，长出愈伤组织或释放出胚状体。将愈伤组织及时转移到分化培养基上，以便进一步分化出再生植株。4进一步鉴定和筛选：常常会出现染色体倍性的变化无菌条件不损伤花药去除花丝7-10个25℃不需要光照需要光照主要原因是花粉管核和生殖核融合造成的选材是否恰当选材是否成功是花药培养成功的关键。应学会通过显微镜观察处于适宜发育期的花粉。课题成果评价课题成果评价课题成果评价课题成果评价无菌技术是否过关如果出现了污染现象，说明某些操作步骤，如培养基灭菌、花蕾消毒或接种等有问题。课题成果评价接种是否成功如果接种的花药长出愈伤组织或释放出胚状体，花药培养的第一步就成功了。要适时转换培养基，以便愈伤组织或胚状体进一步分化成再生植株。课题成果评价项目相同点不同点植物组织培养技术花药培养技术植物组织培养技术与花药培养技术的异同点离体的植物组织经脱分化形成愈伤组织，再分化成丛芽，诱导出根，然后进行移栽。外植体为体细胞，染色体数无需加倍。(无性生殖）取材为花药，培养的为单倍体幼苗，植株弱小，高度不育，必须用秋水仙素处理，使染色体加倍，恢复正常植株的染色体数，而且为纯种。（有性生殖）课后练习1F2代紫色甜玉米的基因型组成可能为Aasusu或AAsusu。如果运用常规育种方法，将F2代中的紫色甜玉米与白色甜玉米（aasusu）进行测交，可以选择出基因型为AAsusu纯种紫色甜玉米。但这种方法比较繁琐，耗时也较长，需要至少三年的选种和育种时间。激素激素种类和浓度对花药培养的影响花药壁分化程度高，重新分裂需要较高的激素浓度才能启动。因此，花药培养基的激素水平要相对较低才能抑制二倍体细胞的分裂。确定适宜的激素浓度，以促使花粉细胞分裂的同时又抑制花药二倍体细胞分裂是成功获得单倍体的关键。知识拓展：诱导培养：多数植物用2,4-D和KT，但浓度不同。有些植物用BA和NAA。2,4-D和KT浓度对诱导单倍体的频率有较大影响，高浓度2,4-D主要诱导花药形成愈伤组织，不能形成胚状体，所以2,4-D激素水平要相对较低。知识拓展：一、被子植物的花粉发育2）、器官发生途径：由愈伤组织或外植体诱导形成不定根或不定芽，再获得再生植株的方法。百合鳞叶培养外植体器官发生途径概述不同营养条件对植物组织培养的影响GrowthmediumisoptimisedforregenerationofplantletsNosucrose(0%)Sucrosereducedto1%Sucroseincreasedto5%Theexplantiscompletelycoveredwithgreenshoots,androotsaredevelopingonthelowersurfaceVeryfewshootshavedevelopedontheexplant.Norootsandnocallus.Shootsdevelopedonedgesofuppersurface,andsomerootdevelopmenthasoccuredShootshavedevelopedoverthesurfaceoftheexplant,alongwithrootsfromthelowersurface.Theresultiscomparablewiththecontrolmedium二、相关知识NoBAPBAPreducedto0.1mg.l-1NoNAAPoorshootdevelopmentandnoroots.ExtensivecallusgenerationPoorshootdevelopmentandnorootsNAAreducedto0.1mg.l-1Morebalanceddevelopmentofrootsandshoots.However,undifferentiatedcallusisdevelopingattheedgesoftheexplantProfusedevelopmentofrootsandareducednumberofshoots.Undifferentiatedcallusisdevelopingattheedgesoftheexplant二、相关知识NAAincreasedto5.0mg.l-1Profusedevelopmentofrootsovertheexplantupperandlowersurface,andfewshoots.SomecallusNoMSsaltsNosignofregenerationfromexplantatall.MSsaltsreducedto0.47g.l-1SomerootgrowthbutreduceddevelopmentofshootsMSsaltsincreasedto9.52g.l-1Shootsdevelopedonuppersurfaceofexplant.Norootsorcallus.二、相关知识一般根据组培植株的再生途径不同可分两大类（一）器官发生:1、直接发生：直接从外植体的细胞形成器官原基，然后发育成器官。2、间接发生：先形成愈伤组织，再由愈伤组织产生不同的器官原基，后形成不同器官。（二）体细胞胚胎发生:1、直接途径：指从外植体某些部位的胚性细胞直接诱导分化出体细胞胚胎.2、间接途径:外植体先脱分化形成愈伤组织，再由愈伤组织的某些细胞重新“决定”为胚性细胞，进而分化出体细胞胚胎。愈伤组织芽分化再生苗胚状体小麦愈伤组织器官发生途径概述人工种子人工种子是指通过植物组织培养技术获得具有胚芽、胚根、胚轴等结构的植物胚状体，并且用适当方法将胚状体包裹起来，用以代替天然种子进行繁殖的一种结构。目前研制的人工种子，是由胚状体、作为保护性外壳的人工种皮和提供发育所需营养的人工胚乳三部分组成的。能在一定的条件下萌发生长，形成完整植株。人工种子的优点:首先，它解决了有些作物品种繁殖能力差、