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目的基因的连接、转化分类及原理分类：根据限制性内切酶酶切后产生的末端的类型，分为非互补突出末端的连接、相同粘性末端的连接、平末端连接DNA连接示意图载体自连及去磷酸化常用碱性磷酸酶BAP（大肠杆菌）CIAP(小牛肠)分子量80,000温度60℃—65℃最适PH8.0热稳定性好，100℃暂时性失活，室温放置可恢复活性，苯酚完全失活分子量100,000温度37℃最适PH10.0附近（高底物浓度）PH8.0附近（低底物浓度）65℃30分钟处理99％的活性不可逆失活，随具体条件改变有变动，完全失活苯酚处理本实验连接材料及连接体系连接示意图连接体系载体DNA17ng目的DNA50ng连接缓冲液（5×）1.2ul用蒸馏水稀释至6ul附注：目的DNA的总体积是3ul，如果不够总质量以总体积为准1.载体和插入片段的摩尔浓度比载体：插入片段的摩尔数的变化范围可为8：1到1：16，但通常的变化范围是3：1到1：3。插入片段的长度和序列的变化会影响和同一载体的连接效果。每一个连接反应都需要作实验，来选择最佳的载体和插入片段的摩尔数比。在最小的反应体积中，通常一个连接反应用10-50ng的载体DNA。2.进行连接反应时的保温的时间和温度也需优化。一般而言，平末端连接在22℃保温4-16小时，粘性末端在22℃保温3小时，或16℃保温16小时。大多数连接反应用T4DNA连接酶，但大肠杆菌的DNA连接酶可用于粘性末端的连接，平末端连接时用此酶，活力较低。3.载体和插入片段的纯度应较高，融解的溶剂最好使用灭菌的双蒸水而不是TE，毕竟TE中含有离子，可能影响连接反应。感受态细胞的制备Hanahan法是制备高效感受态细菌的标准方法。这种化学方法制备的感受态细菌的转化效率可达到109cfu/µgDNA。注：1.低温培养，18℃培养至OD600约为0.5；2.超净台无菌操作，低温操作；3.标准质粒的种类不同同种感受态的转化率不同，不同质粒形态转化率也不相同。转化原理1.0℃的CaCl2低渗溶液中，使细胞膨胀，同时Ca2+使细胞膜磷脂层形成液晶结构，使得位于外膜与内膜间隙中的部分核酸酶离开所在区域，这就构成了大肠杆菌人工诱导的感受态；2.加入DNA，Ca2+又与DNA结合形成抗脱氧核糖核酸酶（DNase）的羟基-磷酸钙复合物，并粘附在细菌细胞膜的外表面上；3.经短暂的42℃热脉冲处理后，细菌细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，随之出现许多间隙，致使通透性增加，DNA分子便趁机进入细胞内。Mg2+的存在对DNA的稳定性起很大的作用，MgCl2与CaCl2又对大肠杆菌某些菌株感受态细胞的建立具有独特的协同效应。二甲基亚砜（DMSO）和二巯基苏糖醇（DTT）进一步诱导细胞产生高频感受态的程序，大大提高了大肠杆菌的转化效率。转化示意图连接效率的计算连接效率=转化子数载体质量(个/ng)转化效率××(个/ng)100%