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第一章简介：肽和蛋白质的反相HPLC分析与纯化反相高效液相色谱（RP-HPLC）已经成为一种分析和纯化生物分子广泛而可靠的方法。RP-HPLC在肽、蛋白质分析和纯化方面的重要作用在于它的分离度：RP-HPLC能够分离具有几乎同样序列的多肽，这不仅包括那些胰岛素消化物中的小肽，还包括更大的肽。仅相差一个氨基酸残基的多肽通常可以用RP-HPLC分离，如图1所示的胰岛素变异物的分离。胰岛素变异物的分子量都在5300左右,只是在氨基酸序列上有轻微的不同，即使这样，大部分的变异物都可以用RP-HPLC分离。特别的是，反相色谱能分离人和兔的胰岛素，两者仅在于一个亚甲基的不同——兔胰岛素有一个苏氨酸，而人胰岛素有一个丝氨酸！RP-HPLC对相近胰岛素变异物的分离图1.RP-HPLC分离含有一个不同氨基酸的人和兔胰岛素。色谱柱：VYDAC214TP54洗脱液：27-30%ACN+0.1%TFA，1.5mL/min，25min。科学文献中已有很多用RP-HPLC分离相似多肽的例子。含有一个氧化蛋氨酸的胰岛素样生长因子与其未氧化态类似物已得到分离，白细胞介素-2突变蛋白也已经得到分离。在最近的论文中，Kunitani及其同事提出，RP-HPLC的保留时间能提供保留在反相表面的蛋白质的结构信息。他们研究了30种白细胞介素-2突变蛋白，并分离了几乎相同的突变蛋白。含氧化蛋氨酸的白介素与其自然状态得到分离，另外，单个氨基酸取代基也被与其自然状态分离。他们得出结论：蛋白质的结构在反相分离中非常重要，同时，RP-HPLC也能用来研究蛋白质的结构。在该过程中，他们展示了RP-HPLC技术对相似多肽的分离能力。RP-HPLC用于分离酶消化产物中的肽碎片，纯化天然肽及合成肽。制备RP-HPLC常常用于纯化克及毫克量的合成肽。RP-HPLC能用于分离血红蛋白变体，鉴别微粒种类，研究酶亚基和细胞功能。RP-HPLC还能纯化用于序列测定的微量级肽，并纯化治疗用的毫克级到千克级生物技术衍生多肽。反相HPLC广泛用于生物制药领域的蛋白质治疗制品的分析。通过分析蛋白质治疗制品的酶消化物能识别蛋白质，并检测基因变化与蛋白质降解（脱酰氨和氧化）产物。用RP-HPLC分析完整蛋白质，能验证蛋白质的结构并测定降解产物。随着生物技术革命的扩展，该色谱技术的应用也随之扩大。在过去的几年中，仅涉及VYDAC反相色谱柱方面的专利数目就已呈现指数级的增长，如图2（又见参考资料74）。用GraceVydac反相HPLC色谱柱发表的专利数图2。美国专利局公布的1984-2000年间在专利中使用VYDAC®反相HPLC色谱柱的专利数。第二章多肽与RP-HPLC色谱柱的作用机制了解多肽与反相表面的作用机制对于理解RP-HPLC的多肽分离很重要。小分子的分离与分子在流动相和疏水性的固定相之间的连续分配有关。但是多肽分子很大，很难分配到疏水相之中；它们进入色谱柱后就吸附到疏水相的表面，直到有机调节剂的浓度达到临界浓度时才会脱附（图3）。脱附后，多肽分子顺着柱子洗脱下来，它们与固定相表面就只有轻微的作用了。多肽/反相之间相互作用的吸附/脱附模型图3.流动相中的多肽进入色谱柱。多肽的“疏水脚”吸附到疏水性的反相材料表面，当有机调节剂浓度升到临界浓度时，多肽就脱附下来了。可以认为多肽是“坐在”固定相上面的，多肽分子的大部分都暴露在流动相中，只有一部分——“疏水脚”——与反相表面接触。RP-HPLC是基于多肽之间“疏水脚”的微小差别来分离多肽的。“疏水脚”的不同源于氨基酸序列的不同与结构的不同。多肽与疏水相之间吸附/脱附机制的关键由于脱附多肽所需的有机调节剂分子的数目（Geng和Regnier称之为“Z”值）非常精确，所以脱附只在很狭窄的有机调节剂浓度范围内发生。这使得多肽只有在有机调节剂达到临界浓度时才发生突然脱附，否则它们将全部被保留在色谱柱中（图4）。多肽脱附对精确浓度的敏感性，是分离多肽时RP-HPLC具有选择性的原因。当到达临界浓度时，多肽突然脱附并产生尖峰。“Z”值对蛋白质结构的敏感性和在调节剂临界浓度时的突然脱附，使得RP-HPLC能分离非常相似的多肽（见第2页）。分子保留时间与有机调节剂浓度图4.A：由于是通过分配而保留，联苯等小分子的保留时间随着有机调节剂浓度的增加而逐渐减少。B：当有机调节剂浓度达到能脱附多肽的临界浓度时，溶解酵素等多肽的保留时间发生突然而剧烈的变化，证明了多肽—反相表面之间相互作用的吸附/脱附模型。使多肽能够得以分离的“疏水脚”对分子结构非常敏感。RP-HPLC对蛋白质结构的敏感性，使其不仅能分离疏水脚不同的多肽，还能分离分子中其它地方存在差别的多肽。Kunitani和Johnson发现，由于结构的差异，非常相似的白细胞介素-2突变蛋白也能得到分离，包括存在一个氧化蛋氨酸的差别或单个氨基酸取代基的不同。Geng和Regnier发现，虽然“Z”值与变性蛋白的分子量有关，但是，具有完整三级结构的蛋白质比预想的要早洗脱出来，因为在蛋白质与固定相的相互作用中只涉及到“疏水脚”，蛋白质的其它部分是与流动相接触的。多肽在色谱柱中的吸附/脱附只发生一次。脱附后，多肽和反相柱子表面就没有什么相互作用了，随后的相互作用也不会对分离产生多少影响。这种相互作用的机制的实际结果是：多肽对有机调节剂的浓度非常敏感。多肽洗脱对有机调节剂浓度的敏感性如图5所示。溶菌酶的保留时间发生了很大变化，而乙腈的浓度相对地只有微小变化。多肽的保留时间对调节剂浓度微小变化的敏感性使得等度洗脱比较困难，因为有机调节剂地浓度必须维持在非常精确的范围内。多肽RP-HPLC分离通常采用梯度洗脱，即使梯度很小（即单位时间内有机调节剂浓度变化很小）。乙腈浓度对洗脱的影响图5.ACN浓度为39%时，溶解酵素的保留时间约为18分钟。ACN的浓度增加到40%时，保留时间减少一半还多，只有7.6分钟。ACN浓度增加到42%时，溶解酵素的保留时间又减少一半，只有3.1分钟。色谱柱：VYDAC214TP54洗脱液：39%、40%、42%ACN+0.1%TFA。当等度分离不适用时，可以采用小梯度有效地分离相似的多肽。小肽进行色谱分离时分配和吸附同时发生。当有机调节剂浓度变化时，它们脱附的速度比发生分配的小分子要快，但与蛋白质相比，它们是逐渐脱附的（图6），说明其分离机制是混合的。把肽保留时间和侧链疏水性联系起来的努力部分是成功的，但是由于许多肽的三级结构的限制，这种相互作用只发生在分子中的部分位置上，造成了大部分模型预测的差异。由此可见，螺旋状肽上疏水残基的精确位置，在预测肽的保留值时很重要。由于大的多肽扩散缓慢，所以其RP-HPLC的峰比小分子的要宽。等度洗脱的多肽的峰宽是分子量的函数，肌球素等大分子肽的柱效只有联苯等小分子柱效的5-10％。多肽通常采用梯度洗脱，即使梯度很小，因为与用等度洗脱相比这样能得到尖峰。多肽分离很少采用等度洗脱。肽的保留时间图6.很多肽在RP-HPLC色谱柱上的保留时间位于蛋白质和小分子之间。小肽Pentaphenylanine比小分子的联苯脱附得快，但比溶菌酶慢。小肽的色谱机理似乎是混合的。第三章多肽反相HPLC分离中色谱柱的作用HPLC色谱柱为多肽吸附提供疏水性的表面。色谱柱由不锈钢管构成,内部填充微径、球形的吸附微粒，微粒通常采用硅胶，硅胶微粒的表面已经用硅烷试剂反应过以使其疏水。合成聚合物（比如聚苯乙烯-二乙烯基苯）也可以用作多肽的HPLC吸附剂。吸附剂的孔径HPLC吸附剂是多孔微粒，用于反应的表面大部分位于小孔中。因此，多肽分子必须进入孔中才能被吸附和分离。HPLC曾多年使用孔径约100Å的微粒。这种多肽色谱法很差，部分是因为许多多肽分子太大而无法进入这种直径的孔中。GraceVydac为HPLC改进的大孔径(～300Å)球形硅胶微粒宣告了用RP-HPLC有效分离多肽的开始。今天，虽然有些肽(～2000MW)也能用100Å孔径的微粒分离，但大多数多肽都是用孔径约300Å的微粒填充色谱柱来完成分离的。吸附剂粒度色谱柱中吸附剂的粒度影响洗脱峰宽，小直径的微粒通常产生更尖的峰和更高的分离度。毛细分析和少量制备分离推荐使用5微米材料（色谱柱内径10mm)。直径大一点的实验室色谱柱通常装填10µm的材料。内径大于22mm的过程色谱柱通常装填15µm或更大的微粒，其粒度分配也比用于分析型色谱柱的宽（见40-42页）。色谱柱的选择与样品分子的特性图7.不同分子量和疏水性所推荐的粒度和结合力吸附相种类通过氯硅烷把疏水相键合到硅胶基质上就形成了反相HPLC吸附剂，这些硅胶基质分子上有一个能附着疏水基团的活性氯基。形成疏水相的烃基通常是十八碳(C18)、八碳(C8)或四碳(C4)的线性脂肪族烃。烃链的长度在蛋白质分离效果上一般没有什么不同。分离给定大小和疏水性的多肽时哪种固定相可能最有效有规可循，参见图7中的总结。对于肽和少于5000道尔顿的小分子蛋白质最好选用C18色谱柱。最小的分子和最亲水的肽通常在小孔的C18柱子上分离得最好。大于5000道尔顿的蛋白质或小分子多肽非常疏水，最好选用C4色谱柱。C8柱与C18色谱柱的应用差不多，但分离个别肽时有时表现出不同的选择性和分离能力。苯基柱没有C4柱子那么疏水，所以对有些多肽表现出独特的选择性。反相表面的细微差别有时会造成RP-HPLC对多肽选择性的不同，可以利用这一点来优化特定肽的分离。如图8所示，肽分离的选择性可能受疏水表面性质的影响。图中所示的五种肽的选择性在C18和C4色谱柱上几乎一样，虽然在C4柱子中的保留时间短。苯基柱与C18柱相比，保留时间短，选择性也不同。缓激肽含有两个苯丙氨酸，与其它肽相比，其在苯基柱上的保留时间比在C18柱上稍长。不同反相色谱柱上的肽分离图8.肽在不同反相色谱柱上的分离。色谱柱：VYDAC218TP54(C18);214TP54(C4);219TP54（苯基）洗脱液：15-30%ACN+0.1%TFA，1.0mL/min，30min样品：1.催产素，2.缓激肽，3.血管紧张素II，4.神经紧张素，5.血管紧张素I血管紧张素I含有一个组胺酸，血管紧张素II含有两个组胺酸。在苯基柱子上，这两者都比其它肽洗脱得早。分离肽时（比如蛋白质消化物中的肽），最好试用不同的疏水相，以选出针对特定肽混合物具有最佳选择性的相来。肽的RP-HPLC分离基于肽和反相表面之间的微妙作用。反相表面的微小变化能影响肽的分离，虽然小但很重要。有些肽的分离对键合在硅胶基质上的疏水相的密度和均匀度非常敏感（图9）。低碳装填色谱柱分离度的提高图9.低碳装填C18RP-HPLC色谱柱（B）分离在标准碳装填色谱柱（A）上只有部分分离的两种肽。色谱柱：A.VYDAC218TP52-标准C18,5μm,2.1x250mmB.VYDAC218LTP52低碳负载C18，5μm,2.1x250mm洗脱液：6mMTFA/4mMHFBA，11-95%ACN,0.25mL/min,75min样品：Asp-N蛋白质消解物。不同的反相吸附剂在分离蛋白质酶消化物中的肽碎片时可能表现出不同的选择性。用两种RP-HPLC色谱柱分离β-乳球蛋白A的胰蛋白酶消化物碎片，结果表明：不同的相有时对肽的反相分离具有微小的影响（图10）。与通常使用的C18色谱柱相比，C4柱的保留时间稍短，肽碎片洗脱图形也有某些程度上的不同。测试不同的色谱柱是确定哪个柱子分离度最好的唯一实用的方法。有些实验室利用反相色谱柱的选择性差异来进行肽的二维分离。不同反相色谱柱对胰蛋白酶消化液的分离图10.色谱柱：VYDAC218TP54(C18)；214TP54(C4)；洗脱液：0-30%ACN+0.1%TFA水溶液，1.0mL/min，60min。样品：β-乳球蛋白A的胰蛋白酶消化液。什么是聚合物键合？它又是怎样影响肽的选择性的？反相HPLC吸附剂一般通过把含有一个活性氯的氯硅烷烃键合到硅胶基质上制成。这些就形成了所谓的单体键合相，它在硅胶基质上有一个附着点。也可以用具有多个活性氯的氯硅烷烃，这就是所谓的聚合物键合相，单个氯硅