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本科学生综合性实验报告学号074120267姓名吴永文学院生科院专业、班级07级应生B班实验课程名称遗传学实验教师及职称曹能（副教授）开课学期2008至2009学年下学期填报时间2009年6月5日云南师范大学教务处编印一．实验设计方案实验序号十一实验名称诱变物质的微核实验实验时间2012年10月30日~11月6日实验室睿智楼3幢222室1．实验目的：（1）、了解微核发生的机制；（2）、掌握微核实验的一般程序和实践意义；（3）、掌握对实验动物进行药物处理的一般程序；（4）、掌握进行实验设计的一般程序和规则，并锻炼实践能力。2．实验原理、实验流程：（1）、实验原理：微核（Micronucleus）：微核主要是由外界损害因素(生物、物理、化学)作用致使细胞染色体丢失或断裂，在有丝分裂后期丧失着丝粒的染色体断片或染色体因纺锤体受损而在分裂过程中行动滞后，分裂末期不能进入主核，形成了主核之外的核块，而在细胞浆中形成1个或数个独立于主核、直径小于主核的1/3、染色与主核一致但比主核淡的核小体，因比主核小，故称为微核。微核率的大小与作用因子的剂量或辐射累积效应呈正相关。凡能使染色体发生断裂或使染色体和纺锤体联结损伤的化学物，都可用微核试验来检测。各种类型的骨髓细胞都可形成微核，但有核细胞的胞质少，微核与正常核难以鉴别。嗜多染红细胞是分裂后期的红细胞由幼年发展为成熟红细胞的一个阶段，此时红细胞的主核已被排出，因胞质内含有核糖体，Giemsa染色后呈灰蓝色，成熟红细胞的核糖体已消失，被染成淡桔红色。骨髓中嗜多染红细胞数量充足，微核容易辨认，而且微核自发率低，因此，骨髓中嗜多染红细胞成为微核试验的首选细胞群。本法用Giemsa染色法观察嗜多染红细胞的微核，嗜多染红细胞呈灰蓝色，成熟红细胞呈粉红色。典型的微核多为单个的、圆形、边缘光滑整齐，嗜色性与核质一致，呈紫红色或蓝紫色，直径通常为红细胞的1/20～1/5。（2）、实验流程：购买小白鼠（体重为25g-35g，最好雌雄各半）设置受试组和对照组并对小鼠进行腹腔注射断颈制取骨髓离心并涂片固定后保存Giemsa染色后冲洗封片并观察、计数。3．实验设备及材料：（1）、实验器材：显微镜、解剖剪、镊子、注射器、载玻片、树胶、盖玻片、塑料吸瓶、吸水纸及对苯二酚、秋水仙素、氯化、环磷酰胺、蒸馏水等；（2）试剂配置：①小牛血清（灭活）:将滤菌的小牛血清置于56℃恒温水浴保温30min灭活。灭活的小牛血清通常保存于冰箱冷冻室里；②姬姆萨（Giemsa）原染液：将Giemsa染料3.8g置于研钵里研细，再加入甲醇至375mL和甘油125mL，混合均匀，放置37℃恒温箱中保温48h。保温期间，振摇数次，促使染料的充分溶解，取出过滤，两周后用；③Giemsa应用液：取2mlGiemsa染液与40ml0.1mol/L磷酸盐缓冲液混合而成。临用现配；④0.1mol/L磷酸盐缓冲液（pH6.8）:将已预先配置好的71.64g/L磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）、31.21g/L磷酸二氢钠（NaH2PO4·2H2PO4）分别取51ml和49ml，加入100ml蒸馏水并混合均匀。4．实验方法步骤及注意事项：（1）实验步骤:①选购小白鼠(体重为25g—35g)；②剂量分组：受试物对苯二酚、秋水仙素、氯化汞分别设3个剂量，每个剂量组用5只小白鼠，各种受试物的剂量设置情况如下所示（单位mg/Kg）：对苯二酚：120、80、40；秋水仙素：10、5、1；氯化汞：3、2、1。另外，用蒸馏水、环磷酰胺分别作为溶剂对照和阳性物对照组，其中环磷酰胺剂量可为40mg/kg；③用腹腔注射24小时后，用断颈法处死小鼠。用剪刀剪开腿部的皮肤，用镊子夹住小鼠的股骨，将小鼠的两股骨取出，剪去和擦净股骨上的肌肉。剪去股骨的髋面，将吸有0.85%Nacl生理等渗液的注射器针头插入，反复几次吹洗出骨髓细胞并使其混合均匀，制成细胞悬液，再将细胞悬液在1000转/分离心5分钟，弃除上清液；④向离心管中加入少量的小牛血清（约0.3ml)混匀后，按常规血涂片法涂片，长度约2cm—3cm，在空气中晾干。然后将干燥的涂片放入甲醇液中固定5min；⑤将固定过的涂片放入Giemsa应用液中，染色20min—30min，然后立即用0.1mol/L磷酸盐缓冲液冲洗，用滤纸及时擦干染片背面的水滴，再用双层滤纸轻轻按压染片以吸附其上的残留水分，促其尽快晾干后放入二甲苯中透明5min，滴上适量光学树脂胶，盖上盖玻片后贴好标签；⑥先后用低、高倍镜粗略检查，选择细胞分布均匀、细胞无损、着色适当的区域，再在油浸镜下对含微核的有核细胞进行计数；⑦观察与计数：每只动物计数1000个嗜多染红细胞，观察含有微核的嗜多染红细胞数，微核率以千分率表示。统计所得数据可利用统计学软件SPSS的单因素方差分析或t检验等方法进行处理，并分析实验结果。5．实验数据处理方法：按照使用说明利用统计学软件SPSS的单因素方差分析方法对实验结果进行处理。6．参考文献：[1]孟紫强，阮爱东，桑楠等.SO2污染对小鼠骨髓嗜多染红细胞微核的诱发作用.环境科学，2002，23（4）123-125.[2]孟紫强，桑楠，张波等.二氧化硫体内衍生物诱发小鼠骨髓嗜多染红细胞微核的效应.环境科学学报，2000，20（2）239-243.[3]耿德贵，王秀琴，刘士旺等.除草剂使它隆对黄鳝细胞的致突变作用研究.环境与健康杂志，2000，17（2）103-105.[4]周晓蓉，李百祥，邱向红等.小鼠骨髓及肝血中嗜多染红细胞微核率的比较.卫生毒理学杂志，1999，13（1）66-67.[5]曹佳.微核实验在中国的应用、发展与展望.遗传，2003，25（1）73-76.二．实验报告1．实验现象与结果：⑴、各受试物剂量组微核统计情况：受试物剂量（mg/Kg）组别各受试小鼠1000个受检细胞中含微核细胞数123456789101112总计对苯二酚1201383335373435363032363337416802283130322928332734302932363403202521232826242227211923279秋水仙素313633323435313137303436324011.5229252326242725242329302631113242123201925221929242622274氯化汞312225202621232218252719242722216222119201817151823252423813131715161415171310112016177阴性对照蒸馏水40mg/kg体重32143539246547阳性对照环磷酰胺40mg/kg体重241421293233502036412344367⑵、根据上述实验结果经统计分析可得各组受试物微核千分率的相关情况：受试物剂量（mg/kg）受检细胞总数（个）含微核细胞数平均微核千分率（‰）标准误对苯二酚1201200041634．670.68801200036330．250.63401200027923．250.82秋水仙素31200040133．410.661.51200031125．910.6911200027422．830.86氯化汞31200027222．670.8021200023819．830.9311200017714．750.82阴性对照蒸馏水40mg/kg体重12000473．920.62阳性对照环磷酰胺40mg/kg体重1200036730．5838.412．对实验现象、实验结果的分析及其结论：⑴、实验现象（观察结果）：将制作好的小鼠骨髓细胞微核涂片分别先后置于低、高倍镜下观察、识别小鼠骨髓细胞微核的形态及染色，可观察到其染色呈灰蓝色，嗜多染红细胞中的微核呈紫红色或蓝紫色的较小圆形、边缘光滑的微粒。其图片如下所示：⑵、对实验结果的分析：根据实验所得结果用Excel进行作图可得如下图象：各组受试物微核率050100150200250300350400450120804031.5132140mg/kg体重40mg/kg体重123123123阴性阳性对苯二酚秋水仙素氯化汞对照组受试物及其剂量（mg/kg）含微核细胞数从上图中我们可以看出试验所用的受试物对小鼠的染色体都有一定的损害作用，从而是小鼠骨髓细胞产生微核，且对于同一种受试物其所用剂量越大，则其对应的微核率越高，即微核率的大小与受试物（作用因子）的剂量呈正比。另外，我们也可以从阴性对照组微核检出率不足0.5％中看出小鼠骨髓细胞中自发的微核率明显低于各组受试物和阳性对照组的结果，这说明在自然条件下小鼠骨髓细胞中同样存在染色体受损的情况，此次实验人为注射的各组受试物的微核率较高，表明它们对染色体的纺锤体或着丝点功能有损害作用的物质，为微核试验阳性物质。3．实验总结：⑴、注意事项：①在实验过程中应防止小牛血清受到污染，胸骨须擦拭干净，以免影响结果配；②为保证Giemsa应用液的染色效果应该先用现配；③在对离心之后最终得到的小鼠骨髓细胞悬液进行涂片时必须一次涂成，而且用力要轻,否则会使细胞受到损坏,而且涂片不要过厚或过薄，以免影响观察；④对于制作好的骨髓细胞涂片即使当日不染色，也应该用Giemsa应用液固定后保存；⑤对已经制作好的涂片进行制片质量的评定时，须以有核细胞形态、染色完好作为判断制片优劣的标准，观察时选择分布均匀、疏密适度、形态完整、染色好的区域镜检，由低倍镜到高倍镜，并按一定顺序镜检；⑥此次实验用于制片透明的二甲苯为有毒物质，在透明的过程中要即使将盖子盖好，注意不要将其泼洒在实验桌或者沾到皮肤，若出现池中情况应该及时用自来水冲洗；⑦最后在将涂片制成永久封片时，用注意所用的光学树脂胶应适量，过多容易使树胶溢出而容易沾在盖玻片表面而使制片清晰度下降，影响观察；⑧注意微核与颗粒异物、嗜多染红细胞与其他骨髓细胞不同阶段血细胞的区分。⑵、个人收获及经验：经过此次综合性实验我基本上掌握了核实验的一般程序、对实验动物进行药物处理的腹腔注射法，了解到了微核实验的实践意义。⑶、不足之处和改进：①在将涂片制成永久封片时所用的光学树脂胶过多，使树胶溢出而容易沾在盖玻片表面而使制片清晰度、封片质量下降；②尚未掌握统计学软件SPSS的基本使用方法，对利用SPSS的单因素方差分析或t检验等方法进行处理和分析实验结果的步骤也感到有些生疏。而SPSS是一个重要的生物学统计软件，因此需要在加强相关软件的使用技能。教师评语及评分：签名：年月日