第5章-生物反应器

上一内容下一内容回主目录返回第五章生物反应器目录第一节生物反应器的基本知识第二节培养基预处理设备第三节菌种制备设备全国高等学校高职高专药品类专业卫生部“十一五”规划教材《生物制药设备》第四节发酵设备第五节动植物细胞培养设备上一内容下一内容回主目录返回学习目标学习目的学习生物反应器的结构和工作原理，培养生物反应器操作技能，为发酵操作、细胞培养操作打下知识和技能基础。知识要求掌握机械搅拌通风发酵罐、气升式发酵罐、鼓泡塔式发酵罐、膜反应器的结构；熟悉机械搅拌通风发酵罐、气升式发酵罐、常用动植物细胞培养器的工作原理；了解灭菌、无菌操作基本原理，了解生物反应器参数检测与自动控制原理；了解参数检测仪器的工作原理。能力要求熟练应用机械搅拌通风发酵罐、气升式发酵罐的基本操作技术；学会培养基灭菌与无菌操作。上一内容下一内容回主目录返回生物反应在狭义上是指活细胞中的各种生物化学反应。广义的生物反应是指生物体的新陈代谢过程。一、生物反应过程（一）概述第一节生物反应基本知识1.生物反应上一内容下一内容回主目录返回2.影响生物反应的因素环境温度、酸碱度、营养物质浓度、氧气浓度、二氧化碳浓度、机械尺寸、流体湍流程度、细胞的生长浓度、产物的生成速度等上一内容下一内容回主目录返回3.生物药物的产生细胞在新陈代谢过程中不断地同化物质和能量，并异化自身物质。细胞的分解产物，部分能用于人类疾病的诊断、预防和治疗，称之为生物药物。上一内容下一内容回主目录返回另外，细胞在生命活动过程中对环境物质进行了转化，部分转化产物也是生物药物；还有用酶工程技术转化后的部分产物也是生物药物。（二）分批培养中的细胞生长模式将培养基一次性投入反应器中，接入细胞并维持细胞生长的过程叫分批培养。在分批培养过程中，随着时间的延长，营养物逐渐被消耗，新的细胞不断增加，产物的数量在逐渐累积，细胞生长过程处于动态变化的环境中。上一内容下一内容回主目录返回减速生长期指数生长期分批培养细胞生长的六个阶段停滞期加速生长期平衡生长期负生长期上一内容下一内容回主目录返回接种后，细胞需要适应环境后才开始加速生长，随后增长速度不断加快，以指数的数量关系扩大繁殖。但随着时间的延长，容器内新生细胞增多，细胞的增长速度逐渐降低。并且部分细胞死亡，扩大繁殖速度减小，死亡速度增大，死亡与生长速度达到平衡。随后死亡速度不断加快，打破平衡后成为负增长，直至培养过程结束。上一内容下一内容回主目录返回（三）生物反应过程的氧气供给1.氧气的传递过程空气被通入反应液后即分散成大量气泡，氧分子从气泡内穿过气液界面进入到反应液内成为溶解氧。（1）氧的气液传递过程溶解氧穿过液固界面进入细胞内的过程。（2）氧的液固传递过程上一内容下一内容回主目录返回2.提高氧气传递速度的途径双膜理论气液界面上的传质阻力主要集中在气膜和液膜的滞流底层，滞流底层越厚阻力越大，液体的黏度越大，滞流底层越厚，传质阻力也越大上一内容下一内容回主目录返回具体措施：（1）增强搅拌机械搅拌可以增加反应液的湍流程度，促使分散的气泡变得更小、分布更均匀，减少液膜厚度、降低传质阻力；增强搅拌还可增加气液接触面积，延长气泡在反应液中的停留时间。机械搅拌产生的剪切力会伤害细胞，可通过改变叶片减小剪切力。上一内容下一内容回主目录返回（2）提高通气速率通气量越大，反应液中的气泡就越多，溶解氧的浓度就越高。通气能起到一定的搅拌效果。通气量过大，则容易产生大量的泡沫，造成溢罐，产生气泡“过载”现象。（3）控制反应液体积在同样搅拌强度下，反应液体积增大，会降低搅拌的效果。上一内容下一内容回主目录返回（4）改善反应液的性质反应液的黏度影响液膜的表面张力，进而影响液体中气泡合并的难易度。液体中气泡液膜的表面张力加剧气泡的合并倾向。随着生物反应的进行，反应液中细胞分泌物增加，黏度变大，小气泡合并成大气泡，出现起沫现象。加入消泡剂，可以降低液膜的表面张力，阻止气泡的合并。上一内容下一内容回主目录返回二、生物反应器（一）生物反应器的分类进行生物化学反应的空间统称为生物反应器1.生物反应器上一内容下一内容回主目录返回2.分类（1）按反应器内有机体种类微生物反应器植物细胞反应器动物细胞反应器酶反应器生物反应器上一内容下一内容回主目录返回（2）按结构特征罐式反应器管式反应器塔式反应器膜式反应器生物反应器上一内容下一内容回主目录返回生物反应器在生物制药过程中的作用上一内容下一内容回主目录返回（二）生物反应器的操作类型1.简单分批培养培养液一次性全部加入，接种培养一段时间后，将培养液一次性全部放出上一内容下一内容回主目录返回2.补料分批培养开始培养时，培养液没有一次性加足，在培养一定时间后，根据培养液营养成分的消耗情况将部分营养成分连续加入反应器内（称之为补料），培养结束后一次性全部放出。3.反复分批培养在简单分批培养即将结束时，放出大部分的培养液，余下少量作为种子液，补充新鲜培养液后再重新培养，如此反复直至培养不能再延续时，再将发酵液全部放出。上一内容下一内容回主目录返回4.反复补料分批培养又称为半连续发酵，指在补料分批培养中进行一段时间、反应器内培养液体积达到最大无法再继续补料时，将培养液放出一部分，再继续补料，隔一段时间后再放出同样体积，如此反复操作，直到最后将培养液一次性全部放出。上一内容下一内容回主目录返回第二节培养基预处理设备一、培养基灭菌设备（一）蒸汽灭菌原理蒸汽能深入到液体内部，并迅速穿透细胞壁，使细胞整体升温，致使细胞内蛋白质凝固失去生物活性，从而终止了细胞的新陈代谢过程。上一内容下一内容回主目录返回（二）高压蒸汽灭菌锅1.高压蒸汽灭菌锅的结构上一内容下一内容回主目录返回高压蒸汽灭菌锅由内锅、外锅、门盖、压力表、温度计、排气阀、安全阀、电热管、蒸汽发生器等部件构成。上一内容下一内容回主目录返回2.高压蒸汽灭菌锅的操作与维护（1）使用前应清洗干净，进气阀及排气阀有效，加注水。（2）装入灭菌物品：间隔合适，扣上门盖，旋紧密封。（3）预热及排气：加热升温，排除冷空气，当排气阀有蒸汽排出时，关闭排气阀。（4）升压保温：待蒸汽压力升至额定值时，调节热源，或者微开排气阀，使锅内蒸汽压力恒定在额定值。维持规定时间后，停止加热。（5）取出灭菌物品：缓慢排气，待其压力下降至零时，方可打开取物。上一内容下一内容回主目录返回（三）培养基连续灭菌设备1.加热器（1）连消塔的结构套管式连消塔，全塔高2～3m，由蒸汽导管和外套管组成。蒸汽导管上开设有很多小孔，小孔的分布呈下密上疏，蒸汽可从小孔中喷出。小孔的总截面积等于或小于导入管的截面积。上一内容下一内容回主目录返回（2）喷射器结构蒸汽和培养液在喷射器的吸入室中混合均匀，在喉管和扩大段进一步混合均匀后排出。上一内容下一内容回主目录返回（3）维持罐结构主要由筒体、夹套、进料管、出料管、排尽管和测温口组成.维持罐设计安装有无菌呼吸口，以保证外界微生物不能进入维持罐内。维持罐的有效体积应能满足维持时间8～25的需要，填充系数为85%～90%。上一内容下一内容回主目录返回2.连续灭菌流程（1）连消塔加热连续灭菌流程待灭菌的培养基由泵送入连消塔的底部，料液在此被蒸汽加热到灭菌温度，再由顶部流出，进入维持罐，停留一定时间后，再送入喷淋冷却器，冷却至常温。上一内容下一内容回主目录返回（2）喷射加热连续灭菌流程当蒸汽从喷嘴中高速喷出时，与生培养液瞬间混匀并将其加热到灭菌温度。混合液进入维持段管道中继续保温灭菌，管道越长灭菌时间也越长，可根据培养基的性质和灭菌要求确定管道的长度。灭菌后的培养基经过膨胀阀进入真空冷却器瞬间冷却。上一内容下一内容回主目录返回灭菌后的培养基经过膨胀阀进入真空冷却器瞬间冷却上一内容下一内容回主目录返回喷射加热连续灭菌流程是目前常用的培养基灭菌方法，其特点是加热、冷却过程极为短暂，所以将温度升高到140℃而不引起培养液的严重破坏。因维持设备是管道，如果设计合理，则返混程度很小，可保证物料的先进先出，避免了培养基在灭菌过程中局部过热或灭菌不充分的现象发生。上一内容下一内容回主目录返回（3）薄板连续灭菌流程培养液在薄板换热器中可以同时完成预热、加热灭菌、维持及冷却过程。上一内容下一内容回主目录返回二、淀粉糖化设备糊化糖化单糖糊化阶段，淀粉水解转化成糊精；在糖化阶段，糊精被淀粉糖化酶转化成单糖或二糖。上一内容下一内容回主目录返回（一）糊化锅糊化锅用来加热煮沸淀粉原料使其液化和糊化的设备。糊化锅的关键部件有锅盖、锅体、夹套和搅拌器等。上一内容下一内容回主目录返回淀粉类原料从下粉管放入锅内溶液中，蒸汽进入夹套释放热量成冷凝水排出，锅内产生的水蒸气沿升气管上升，部分蒸汽形成冷凝水沿升气管内壁流入环型槽后由排水管排出，为防止锅内局部过热，开启电动机对溶液进行搅拌，促使溶液体系受热均匀。糊化锅的工作过程上一内容下一内容回主目录返回（二）糖化锅糖化锅是糊精水解成单糖或二糖的反应容器，其结构与糊化锅基本相同，单体积更大，约为糊化锅体积的两倍。将糊化后的浆状料液输送到糖化锅中，加水稀释混合，并加入糖化酶，将温度保持在一定的范围内，经一段时间后料浆即可糖化完毕。上一内容下一内容回主目录返回三、双酶制糖工艺淀粉液化酶作用于淀粉α-1,4葡萄糖苷键，将长链的淀粉水解成短链糊精，使淀粉液化，产物以短链的糊精为主，含有少量的葡萄糖。糖化酶可作用于α-1,4或α-1,6葡萄糖苷键，可将糊精完全水解为葡萄糖或麦芽糖，即淀粉的糖化。上一内容下一内容回主目录返回双酶制糖工序有调浆、液化、糖化和过滤。生产设备主要有糊化锅、糖化喷射器、维持罐、冷却装置等。上一内容下一内容回主目录返回第三节发酵罐发酵罐是微生物大量生长繁殖的空间，是一类重要的生物反应器。发酵罐厌氧式发酵罐不需要通入氧气好氧式发酵罐通氧气好氧发酵罐机械搅拌通风发酵罐气升式发酵罐自吸式发酵罐鼓泡塔式发酵罐上一内容下一内容回主目录返回一、机械搅拌通风发酵罐机械搅拌通风发酵罐的主要部件有罐体、搅拌器、挡板、空气分布器、换热器、消泡器、人孔、视镜等。上一内容下一内容回主目录返回1.罐体罐体是空心圆柱体上下两底焊接封头后所构成的容器。圆柱体高径之比为1.7～3。罐体一般采用卫级不锈钢，要求能耐受130℃的高温和的绝对压力。封头上设置有进料管、无菌呼吸口、接种管、人孔、视镜、压力表和取样管等。罐侧壁上设计有各种检测仪器接口以及换热器的进出口。无菌压缩空气从罐底部通入，经空气分布管进入发酵液。上一内容下一内容回主目录返回2.搅拌器搅拌器安装在搅拌轴上，起着将空气分散成气泡并与发酵液充分混合，提高溶氧速率的作用。搅拌器的叶轮有多种形式，有涡轮式和螺旋桨式两种。（1）涡轮式搅拌器中央圆盘上设置六个叶片，可分为平叶式和弯叶式两种。上一内容下一内容回主目录返回（2）螺旋桨式搅拌器采用类似螺旋推进器的结构，在发酵罐内形成由下向上的轴向螺旋运动。上一内容下一内容回主目录返回（3）两类搅拌器的搅拌效果上一内容下一内容回主目录返回可产生较强的涡流扩散效果，气泡分散性好，但主体对流混合较差，容易产生层流。涡轮式搅拌器可在轴向产生较好的主体对流混合，但涡流扩散效果较差，即气泡分散性较弱。螺旋桨式搅拌器两类搅拌器组合使用，既强化气泡的分散，又增强了发酵液的整体混合效果。上一内容下一内容回主目录返回3.轴封连接搅拌器的搅拌轴在电动机的驱动下转动，搅拌轴与罐体间的缝隙通过轴封实现密闭。发酵罐上常采用端面机械轴封。端面机械轴封由动环和静环构成静环由聚四氟乙烯制成动环由碳化钨钢制成，动环和静环具有导热性能好，摩擦系数小等特性。上一内容下一内容回主目录返回上一内容下一内容回主目录返回4.空气分布