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1DNA的粗提取与鉴定【复习目标】1．通过尝试对植物或动物组织中的DNA进行粗提取，了解DNA的物理化学性质。2．理解DNA粗提取与鉴定的原理【基础知识】一、提取DNA的方法提取生物大分子的基本思路是选用一定的物理或化学方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。对于DNA的粗提取而言，就是要利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。1.DNA的溶解性DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的中溶解度不同，利用这一特点，选择适当的盐浓度就能使充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反，以达到分离目的。①在什么浓度下，DNA的溶解度最小？DNA在NaCl溶液中的溶解度是如何变化的？②如何通过控制NaCl溶液的浓度使DNA在盐溶液中溶解或析出？此外，DNA不溶于溶液，但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精。利用这一原理，可以将DNA与蛋白质进一步的分离。2.DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性蛋白酶能水解，但是对没有影响。大多数蛋白质不能忍受60—80oC的高温，而DNA在以上才会变性。洗涤剂能够瓦解，但对DNA没有影响。3.DNA的鉴定在条件下，DNA遇会被染成色，因此二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。二、实验设计1．实验材料的选取：凡是含有的生物材料都可以考虑，但是使用DNA含量较高的生物组织，成功的可能性更大。在下面的生物材料中选取适合的实验材料（2~3种）：鱼卵、猪肝、菜花（花椰菜）、香蕉、鸡血、哺乳动物的红细胞、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜、在液体培养基的大肠杆菌思考：哺乳动物的红细胞的特点？2．破碎细胞，获取含DNA的滤液：动物细胞的破碎比较容易，以鸡血细胞为例，在鸡血细胞液中加入一定量的，同时用搅拌，过滤后收集滤液即可。如果实验材料是植物细胞，需要先用溶解细胞膜。例如，提取洋葱的DNA时，在切碎的洋葱中加入一定的和，进行充分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液。2思考：①为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？②加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？③如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响?④此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分？3．去除滤液中的杂质：基本原理方法目的DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，在的NaCl溶液中的溶解度最低溶于NaCl溶液中并稀释①NaCl溶液浓度为2mol/L时，DNA溶解，部分蛋白质发生盐析而生成沉淀，通过过滤可除去部分蛋白质及不溶于NaCl溶液的杂质；②当NaCl溶液稀释至0.14mol/L时，DNA析出，过滤可除去溶于NaCl中的部分蛋白质和其他杂质DNA不被蛋白酶水解加入嫩肉粉嫩肉粉中含木瓜蛋白酶，可水解蛋白质DNA不溶于酒精溶液加入冷却的体积分数为95%酒精析出DNA，除去溶于酒精的蛋白质4．DNA的析出与鉴定：将处理后的溶液过滤，加入与滤液体积、冷却的，静置2~3min，溶液中会出现色丝状物，这就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水分。取两支20ml的试管，各加入物质的量浓度为的NaCl溶液5ml，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后，向两支试管中各加入4ml的。混合均匀后，将试管置于中加热5min，待试管冷却后，比较两支试管溶液颜色的变化，看看溶解有DNA的溶液是否变。三、操作提示1.以血液为实验材料时，每100ml血液中需要加入3g柠檬酸钠，防止。2.加入洗涤剂后，动作要轻缓、柔和，否则容易产生大量的泡沫，不利于后续步骤地操作。加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免，导致DNA分子不能3.形成絮状沉淀。二苯胺试剂要，否则会影响鉴定的效果。四、实验步骤（一）、植物DNA的粗提取和鉴定1．取材:称取30g的菜花，去梗、切碎。2．研磨:将切碎的菜花放入研钵中，加入洗涤剂和食盐，充分研磨搅拌。3．过滤:在漏斗中放上纱布，进行过滤。4．去除滤液中的杂质：第二次过滤：在滤液中加入2mol/L的3NaCl，。第三次过滤：沿烧杯壁加蒸馏水使NaCl的浓度为0．14mol/L时，析出DNA，用纱布过滤。第四次过滤：将纱布中的DNA溶于2mol/L的NaCl，用二层纱布过滤，去除杂质。5．沉淀：在一倍体积的上清液中倒入体积相等的冷却的酒精，溶液中析出白色丝状物。冷酒精的作用：①抑制核酸水解酶的活性，防止DNA水解。②降低分子运动，使DNA易于析出。③低温有利于增加DNA的柔韧性，减少断裂。6．鉴定：取两支试管，各加入2mol/L的NaCl溶液5ml，将丝状物溶于其中一支试管中，然后向两支试管中各加入4ml的二苯胺试剂，混合均匀，沸水浴加热，待冷却后，比较两支试管的颜色变化。（二）、动物DNA的粗提取和鉴定1．材料制备：0.1G/ml柠檬酸钠100ml500ml烧杯→玻璃棒搅拌→离心2min→吸去上清液→活鸡血180ml即得鸡血细胞液（也可将上述烧杯置于冰箱中，静置一天使鸡血细胞自行沉淀）2．方法步骤：取血细胞液5-10ml＋20ml蒸馏水，玻璃棒沿一个方向快速搅拌（1）提取血细胞核物质纱布过滤，滤液中含DNA和其他核物质，如蛋白质原理：血细胞的细胞膜、核膜吸水胀破，玻璃棒快速搅拌机械加速血细胞破裂（2）溶解核内DNA：滤液＋2mol/LNaCl溶液40ml，玻璃棒沿一个方向搅拌（3）析出含DNA的粘稠物：向上述溶液中缓缓加入蒸馏水，并轻轻地沿一个方向搅拌，出现丝状物，当丝状物不再增加时，停止加水（此时NaCl溶液相当于稀释到0．14mol/L）（4）滤取含DNA的粘稠物：用多层纱布过滤，含DNA的粘稠物留在纱布上（5）（纱布上的）DNA粘稠物再溶解：20ml2mol/LNaCl溶液50ml烧杯，上述粘稠物缓慢搅拌3min（6）过滤含DNA的2mol/LNaCl溶液：用2层纱布过滤，滤液中含DNA（7）提取含杂质较少的DNA：上述溶液＋95%酒精，缓慢搅拌，出现乳白色丝状物，用玻璃棒将丝装物卷起。（8）DNA鉴定：4【习题巩固】1．在“DNA的粗提取与鉴定”的实验中分别使用2mol／L、0．14mol／L、2mol／L、0015mol／L的氯化钠溶液，其作用分别是（）A．溶解、析出、溶解、溶解C．溶解、溶解、析出、溶解B．析出、溶解、析出、溶解D．溶解、析出、溶解、析出2．在DNA的粗提取过程中，初步析出DNA和提取较纯净的DNA所用的药品的浓度和名称分别是（）①0．1g/ml的柠檬酸钠溶液②2．00mol/L的NaCl溶液③0．14mol/L的NaCl溶液④体积分数为95%的酒精溶液⑤0．015mol/L的NaCl溶液⑥0．04mol/L的NaCl溶液A．①③⑤B．③④C．②④D．②③④3．与析出DNA粘稠物有关的叙述，不正确的是（）A．操作时缓缓滴加蒸馏水，降低DNA的溶解度B．在操作A时，用玻璃棒轻缓搅拌，以保证DNA分子完整C．加蒸馏水可同时降低DNA和蛋白质的溶解度，两者均可析出D．当丝状粘稠物不再增加时，此时NaCl的浓度约为0.14mol/L.4．（多选）下列有关“DNA粗提取”的操作中，正确的是（）A．在鸡血细胞液中加入蒸馏水B．在“析出DNA粘稠物”时，要缓缓加入蒸馏水，直至溶液中粘稠物不再增多C．在用酒精凝集DNA时，要使用冷酒精D．玻璃棒搅拌时随意使用5．“DNA的粗提取与鉴定实验”中有三次过滤：（1）过滤用蒸馏水稀释过的鸡血细胞液。（2）过滤含粘稠物的0.14mol/LNaCl.（3）过滤溶解有DNA的2mol/LNaCl.以上三次过滤分别为了获得（）A．含核物质的滤液、纱布上的粘稠物、含DNA的滤液B．含核物质的滤液、滤液中DNA粘稠物、含DNA的滤液C．含核物质的滤液、滤液中DNA粘稠物、纱布中DNAD．含较纯的DNA滤液、纱布上粘稠物、含DNA的滤液6．为获取较纯净的DNA，采集来的血样可用蛋白酶处理，然后用有机溶剂除去蛋白质。下列有关叙述，正确的是（）A．除去血浆中的蛋白质B．除去染色体上的蛋白质C．除去血细胞表面的蛋白质D．除去血细胞中所有的蛋白质7．在“DNA的粗提取与鉴定实验”中，和“使用蛋白酶从染色体中提取DNA”中的蛋白5酶具有相似作用的物质是（）A．NaCl溶液B．蒸馏水C．柠檬酸钠D．冷却的酒精8．DNA不溶于下列何种溶液（）A．NaCl溶液B．KCl溶液C．MgCl溶液D．酒精溶液9．下列操作中，对DNA的提取量影响较小的是（）A．使鸡血细胞在蒸馏水中充分破裂，放出DNA等核物质B．搅拌时，要用玻璃棒沿一个方向轻缓搅动C．在析出DNA粘稠物时，要缓缓加入蒸馏水，直至溶液中粘稠物不再增多D．在用酒精沉淀DNA时，要使用冷酒精，甚至再将混合液放入冰箱中冷却E．在DNA的溶解和再溶解时，要充分搅拌10．在“动物DNA的粗提取与鉴定实验”中：（1）实验中两次使用蒸馏水，第一次目的是，第二次目的是。（2）说明不同浓度的NaCl溶液的作用：2mol/LNaCl的作用；0.14mol/LNaCl的作用；0.015mol/LNaCl的作用；（3）提纯DNA的原理是，所用试剂为。搅拌要，目的。（4）能否用哺乳动物血液代替？简述理由。。此实验中有几次用玻璃棒搅拌，每次搅拌的方向是一致的；但每次搅拌的强度不同，请就此予以说明。（1）提取鸡血细胞核内物质时，应搅拌，目的是。（2）向含核物质的2mol/LNaCl溶液滴加蒸馏水析出DNA粘稠物时，应搅拌，目的是。（3）DNA粘稠物再溶解于2mol/LNaCl溶液时，应搅拌，目的是。（4）用95%的冷却酒精提取含杂质较少的DNA时，应搅拌，目的是。11．以下是有关DNA的粗提取实验的阅读材料：a．核酸极不稳定，在较为剧烈的化学、物理因素和酶的作用下很容易降解。在制备DNA时要加入DNA酶（水解DNA的酶）的抑制剂柠檬酸钠，以除去Mg，防止DNA酶的激活。b．核酸中的DNA和RNA在生物体内均以核蛋白（由核酸和蛋白质组成）的形式存在，DNA核蛋白在1mol/LNaCl溶液中溶解度很大，但在0.14mol/LNaCl溶液中溶解度很低；而RNA核蛋白溶于0.14mol/LNaCl溶液。c．用苯酚处理，可使蛋白质变性，且留在苯酚层内；在DNA溶液中加入2．5倍体积，浓度为95%的酒精，可将DNA分离出来。此时DNA十分粘稠，可用玻璃棒搅成团取出。d．DNA在强酸性环境下，水解产生脱氧核糖等小分子物质，它与二苯胺酸性溶液反应，能生成蓝色化合物。e．实验材料与器械：柠檬酸钠溶液、石英砂、0.14mol/LNaCl溶液、1mol/LNaCl溶液、苯酚、95%的酒精、二苯胺试剂、浓硫酸、花椰菜、研钵、烧杯、漏斗、玻璃棒、量6筒、石棉网、酒精灯、吸管、试管等。以下是DNA粗提取实验的步骤，请根据以上阅读材料回答有关问题：（1）研磨：取10克花椰菜加适量的、和石英砂，研磨成匀浆。（2）过滤。（3）将滤液稀释6倍，其目的是：。（4）离心处理，产生沉淀。（5）取沉淀物，置于2毫升1mol/LNaCl溶液中，使DNA核蛋白再次溶解，再加2毫升苯酚充分震荡后静止，待其分层后弃其上层苯酚。这一步的目的是除去。（6）如何将剩余溶液中的DNA提取出来？。（7）如何证明提取物质确实是DNA分子？。其实验过程的要点是向放有DNA的试管中加入适量该试剂，混合均匀后，将试管置于中5min，待试管后，观察试管中的颜色变化。这个实验也说明DNA耐温，前次温度有利于，后次温度则有利于DNA。12．“DNA的粗提取与鉴定”实验中，A、B、C、D、E五个小组除下表中所列处理方法不同外，其他操作步骤均相同，而且正确，但实验结果却不同。组别实验材料提取核物质时加入的溶液去除杂质时加入的溶液DNA鉴定时加入的试剂A鸡血蒸馏水95％的酒精(25C)二苯胺B菜花蒸馏水95％的酒精(冷却)双缩脲，C人血浆蒸馏水95％的酒精(冷却)二苯胺D人血细胞2mol／L的氯化钠0．14mol／L的氯化钠双缩脲E鸡血蒸馏水95％的酒精(冷却)二苯胺(1)实验材料选择错误的组别是。其原因是。(2)实验步骤(不包括实验材料)均正确，但得不到DNA的组别是。(3)沸水浴中试管颜色变蓝的组别是；蓝色较淡的是，其原因是。(