流式细胞仪原理

流式细胞仪•工作原理•EPICSXL/MCL•FC500MCL/MPL流式细胞术的原理•流式细胞术（FCM）是一种能对单个细胞、分子和生物颗粒（微生物）进行多参数快速检测的新型分析和分选技术。近几年随着多种单克隆抗体的成功制备和多种荧光素的应用。FCM逐步运用于对疾病诊断和治疗监测的临床检验常规工作。基本原理流路•流动室•鞘液SHEATH•样本流SAMPLE单细胞悬液5*105~1*106个/ml光路•光源•检测信号•光电倍增管PMTHV电路•放大电路HV及GAIN增益•A/D转换•统计：计算机流路•单细胞悬液•大多数仪器是在50-300µm大小的孔径中,将细胞悬液注射进入鞘液中•这一过程,成为流体动力学聚焦FLOWCELLInjectorTipFluorescencesignalsFocusedlaserbeamSheathfluid光路光源检测信号散射光信号FS:前向角散射光SS:侧向角散射光(90度散射光)荧光信号荧光染料光学滤片颜色补偿电路----光电倍增管光路•光源与通过的细胞聚焦在同一点上•激光空冷488nmblue,633nmred,325nmUV,514nmgreen,空冷/水冷EnterpriseII水冷Innova300系列Innova70系列检测信号散射光信号—前向散射光(FS)•FS----Forward(AngelLight)Scatter在激光束正前方的检测器,为前向散射光检测器•FS的强度与细胞或其他颗粒的大小,形状及opticalhomogeneity有关•FS用于检测细胞或其他粒子的表面属性如:大小前向散射光散射光信号–侧向散射光•SS-Side(AngelLight)Scatter与激光束垂直方向的检测器为侧向检测器,也称为90度散射光检测器•SS的强度与细胞或其他颗粒的大小,形状及opticalhomogeneity有关•SS用于检测细胞内部结构如:胞浆内颗粒多少,核质比侧向散射光90DegreeScatter02004006008001000ForwardScatter02004006008001000815203040501002001000LymphocytesMonocytesNeutrophilsSideScatterProjectionForwardScatterProjectionLightScatterGatingScale光路-荧光信号•每种荧光染料均有特定的激发波长,并激发后会有发射波长,流式细胞仪检测的即是它特定的发射波长.•利用各种不同波长的光学滤片来收集(检测)这些光学信号荧光染料的特性•激发波长(EXCITING)•发射波长(EMISSION)常用荧光染料的特性荧光染料激发波长(nm)发射波长(nm)用途颜色FITC488525免疫荧光绿色PE(RD1)488575免疫荧光橙色ECD488620免疫荧光橙红PeCy5488675免疫荧光红PI488620DNA染色橙红PECy7488755免疫荧光深红PerCP488670APC633670光路-滤片特性•当以45o角放置滤片时,该滤片可以通过一定波长的光,同时也可以阻断并折射该波长以下的光•这种方式的滤片称为二向色性滤片(dichroicfilter)SourcelightPassedlightCertaincolorsabsorbedAbsorbancefilter标准带通滤片bandpass光源通过的光谱630/30nmBP615-645nmlightUnique4-ColorSingleLaserDesignAir-cooledArgonIonLaserBeamShapingLensesHighSensitivityQuartzFlowCellForwardScatterDetectorSideScatterDetector525BPFL1(FITC)575BPFL2(RD1)620BPFL3(ECD)675BPFL4(PC5)488DL488BK550DL600DL645DLPC7Air-cooledArgonIonLaserBeamShapingLensesHighSensitivityQuartzFlowCellForwardScatterDetectorSideScatterDetector525BPFL1(FITC)575BPFL2(RD1)675BP(PC5)750BPFL4(PC7)488DL488BK550DL600DL700DLOptics-Detectors–Photomultipliertube(PMT)•将光学信号转变为电脉冲(数字数据)信号不同的脉冲信号被转换成数字通道(CHANNEL)的过程LogFITC1000100101110.1Count30700150ImmunophenotypingImmunophenotypingSingleParameterHistogram:CountvsMFI颜色补偿•各荧光染料发射的荧光信号有重迭,因此要进行色补偿以除去重迭部分￫emissionintensitywavelengthFLBFLA光谱重叠需进行色补偿减法颜色补偿•减法补偿–去除叠加信号,在使用双色以上时会产生减得过多的错误–BDFACSCalibur–补偿试剂FITCPECorrectOver-compFITCPEUnder-compFITCPE全矩阵颜色补偿•全矩阵–在每个PMT上对于每一个荧光计算“叠加荧光素”的比率–通过矩阵去除或加上信号•EPICSXL•CytomicsFC500FL1FL2FL3FL4PMT155.00.50.30.3PMT21.747.01.20.3PMT30.67.445.00.3PMT40.21.43.428.0NormalizedRelativeIntensityFL1FL2FL3FL4PMT1100.01.10.71.1PMT23.1100.02.71.1PMT31.115.7100.01.1PMT40.43.07.6100.0PercentageMeanIntensitySingleParameterMnIIOTCD45CD45-ECDPMT1PMT2PMT3PMT4FL1100-1.28-1.08-0.74FL2-3.5100-7.41-0.44FL31.01-41.251000.18FL4-0.046.67-24.40100EPICSXL临床科研型流式细胞仪EPICSXL合理的光路设计------单激光激发四色荧光标准模式确保在同一个细胞上获得最多的信息EPICSXL直线光路设计，光损失少可互换式光学滤片，方便新染料的应用Air-cooledArgonIonLaserBeamShapingLensesHighSensitivityQuartzFlowCellForwardScatterDetectorSideScatterDetector525BPFL1(FITC)575BPFL2(RD1)620BPFL3(ECD)675BPFL4(PC5)488DL488BK550DL600DL645DLAir-cooledArgonIonLaserBeamShapingLensesHighSensitivityQuartzFlowCellForwardScatterDetectorSideScatterDetector525BPFL1(FITC)575BPFL2(RD1)675BP(PC5)750BPFL4(PC7)488DL488BK550DL600DL700DLPC7WithThankstoDr.FrankSchniedersGentherapieGruppe–AbteilungMolekulareZellbiologieInstitutfürMedizinischeBiochemieundMolekularbiologieUniversitätsklinikumHamburg-EppendorfEGFP,EYFPand7-AADWithEPICS®XLTMandEXPO32TMADC-SoftwareHEK293HumanEmbryonalKidneyCells293FilterSetBP510LAF21BP550LAF30DichroicMirror525DRLPCellViabilitywith7-AADHEK293-cellswithEYFPTransfectionHEK293-cellswithEGFPTransfectionMixtureofEGFP-andEYFP-transfectedHEK293-CellsEGFP...EnhancedGreenFluorescentProtein(Ex488;Em507nm)EYFP...EnhancedYellowFluorescentProtein(Ex513;Em527nm)7-AAD...7-Aminoactinomycin(ViabilityStain;Ex546;Em647nm)四色荧光中的补偿传统补偿与ADC补偿EPICSXL采用最先进的通讯传输设计------光纤通讯与数字信号传输EPICSXL中的PRISM功能-----将多张直方图浓缩在一张上HowardM.Shapiro,PracticalFlowCytometry,3rded.,page355“TheXLispresentlyuniqueamongproductionflowcytometerinitsuseofdigitalelectronicsfortransformationbetweenlinearandlogarithmicsignalsandofcomputeralgorithmforfluorescencecompensation.Ihavealreadypraisedthisapproachafewtimes(pp.19,166,189),whilealsonothingthatitprobablyrepresentedtheonlypracticalwaytoimplementanotherfeaturewhichpresentlydistinguishestheEPICSXLfromit’scompetitors,i.e.,4-colorfluorescenceanalysis.Bothfeatureswillhavetheothermanufacturerstryingtoplaycatch-upforawhile.”“XL因為有全數字化的線性-數轉換及電腦軟體螢光補償而成為現今流式細胞分析儀系統中最獨特的產品.個人也多次表示欽佩(第19,166,189頁).EPICSXL(單一激光產生)的四個螢光分析性能,使其鶴立於其他競爭者之中.這些功能將會讓其他廠商花很長的時間來追趕”.摘自”流式細胞分析儀系統實務第三版,1995.”作者HowardM.Shapiro,PracticalFlowCytometry,3rded.,page355专家评述来自ISAC的报告产品介绍XL设计的所有优势：单激光激发四色荧光光纤通讯数字化信号传递可互换式光学滤片，无需调整光路具有620nm的滤片,最适合DNA倍体分析利用软件进行全矩阵优化（ADC)颜色补偿PRISM浓缩柱形图快速调节电压快速调整补偿补偿向导利用生物样本进行颜色补偿WINDOWS界面操作软件Cytomics™FC500•MCL进样–MCL自动模式.–MCL直接(或手动)模式.–单管固定位置进样.–可以暂停/旋转以方便随时添加刺激剂等–条码识别–样本混匀产品介绍：硬件产品介绍：硬件•可选MPL(研究用)•24孔•每孔样本体积0.5–2.5ml•96孔•最少体积200ul•40管(12x75mm)•最少体积500ul•固定样本体积•吸样25ul•样本混匀功能FC500特点•1根激光同时激发5色荧光•2根激光可选•3种进样方式•4种直方图分辨率•5色荧光同时检测全球第一台单激光激发五色荧光的流式细胞仪全球唯一一台获得Qualitylead