流式细胞仪原理及应用

致：流式细胞术概述BDBiosciencesImmuneFunction流式细胞术的基本概念流式细胞术（FlowCytometry,简称FCM）是一种可以快速、准确、客观，并且能够同时检测快速直线流动状态中的单个微粒（通常是细胞）的多项特性，并加以定量的技术，同时可以对特定群体加以分选研究对象为生物颗粒，如各种细胞、微生物及人工合成微球等研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并加以定量BDBiosciencesImmuneFunction流式细胞仪的检测范围细胞结构•细胞大小•细胞颗粒度•细胞表面积•核浆比例•DNA含量与细胞周期•RNA含量•蛋白质含量•……细胞功能•细胞表面/胞浆/核的特异性抗原•细胞活性•细胞内/外的细胞因子•激素结合位点、细胞受体•蛋白磷酸化•pH值•钙离子浓度•细胞膜电位、线粒体膜电位……流式细胞仪的原理BDBiosciencesImmuneFunctionBDBiosciencesImmuneFunction液流系统：鞘液包绕着单行排列的细胞依次高速通过流动池，而激光聚焦于流动池中心的样本流上，随后经检测的样本和鞘液流向废液桶。BDBiosciencesImmuneFunction光学系统：经荧光染色的细胞在激光的照射下产生散射光和荧光信号，同时被前向光电二极管和一组光电倍增管（PMT）接收，荧光信号经一系列双色性反射镜和带通或长通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号BDBiosciencesImmuneFunction电子系统：荧光信号和散射光信号经二极管和PMT接收后可转换为电信号，再通过模/数转换器转换为可被计算机识别的数字信号，以图形的形式呈现给操作者BDBiosciencesImmuneFunction散射光信号FALSSensorLaserBDBiosciencesImmuneFunction散射光信号RightAngleLightDetectorCellComplexitySSCForwardLightDetectorCellSurfaceAreaFSCIncidentLightSource=前向角散射光（FSC,ForwardScatter）细胞相对大小及其表面积=侧向角散射光（SSC,SideScatter）细胞颗粒度及细胞内细胞器的相对复杂性BDBiosciencesImmuneFunction外周全血细胞散射光双参数点图（红细胞溶解后）GranulocytesMonocytesLymphocytesBDBiosciencesImmuneFunction流式细胞仪的检测信号荧光信号•使用荧光标记的单克隆抗体染色，做多色分析•荧光信号的强弱，反映了细胞抗原的表达含量BDBiosciencesImmuneFunction荧光信号双色直接染色BDBiosciencesImmuneFunction数据存储•FCS2.0格式•常以列表模式（LISTMODE)：将每个细胞的每个检测参量依次排列顺序存储FSCSSCFL1FL2Event13060638840Event210016024585Event3300650160720FITC/PE双染样本BDBiosciencesImmuneFunctionBDBiosciencesImmuneFunction数据显示•直方图（Histogram）•二维点图（DotPlot）•等高线图（ContourPlot）•密度图（Density）•三维图（3DPlot）等BDBiosciencesImmuneFunction单参数直方图分析BDBiosciencesImmuneFunction数据分析=直方图分析BDBiosciencesImmuneFunction多参数散点图分析BDBiosciencesImmuneFunction数据分析等高图和密度图分析BDBiosciencesImmuneFunction数据分析三维图分析BDBiosciencesImmuneFunction流式细胞仪的应用BDBiosciencesImmuneFunction流式细胞仪的临床应用=HIV免疫分型，CD4绝对计数=淋巴细胞亚群分析=白血病和淋巴瘤的免疫分型=肿瘤的细胞周期和倍体分析=网织红细胞计数=细胞移植的免疫状态监测=干细胞计数=阵发性血红蛋白尿=HLA-B27检查=血小板功能及相关疾病BDBiosciencesImmuneFunction流式细胞仪的科研应用免疫功能研究血小板分析（心脑血管疾病）细胞周期和倍体分析细胞凋亡干细胞研究树突细胞研究肿瘤相关基因表达的研究抗肿瘤药物作用机制以及多药耐药性的研究放疗/化疗疗效的研究BDBiosciencesImmuneFunction淋巴细胞亚群分析•使用经荧光素标记的特异单克隆抗体，进行多色染色，同时分析淋巴细胞膜上多种白细胞分化抗原（CD分子）的表达，可以将淋巴细胞亚群区分开，进行定性分析•各淋巴细胞亚群的百分含量•淋巴细胞亚群的绝对计数，进行定量分析BDBiosciencesImmuneFunction淋巴细胞亚群分析•根据功能，淋巴细胞主要分为B淋巴细胞（CD19+），与体液免疫有关T淋巴细胞（CD3+），与细胞免疫有关•总T和总B可以用来判断某些免疫缺陷和自身免疫性疾病NK细胞（CD3-CD16+56+），行使免疫监控功能，能够介导对某些肿瘤细胞和病毒感染细胞的细胞毒性作用。BDBiosciencesImmuneFunction淋巴细胞亚群分析根据CD4、CD8表达，T淋巴细胞又分为T辅助/诱导细胞（CD3+CD4+）T抑制/细胞毒性细胞（CD3+CD8+）Th/Ts评价那些自身免疫失调、被怀疑是免疫失调或已知患有免疫缺陷的病人的免疫状态BDBiosciencesImmuneFunction•诊断原发性免疫缺陷病（如先天性无r球蛋白血症）或继发性免疫缺陷病（如AIDS）•造血干细胞移植后免疫重建（6个月NK；9个月T、B）•Th/Ts：机体免疫功能亢进：自身免疫性疾病，如SLE、类风湿性关节炎等（治疗有效恢复正常）•Th/Ts：机体免疫功能低下：AIDS、病毒感染、慢性活动性肝炎和活动性肝硬化、再障、结核、肿瘤等•移植后动态免疫监测：急排临床症状出现前1-5天，活化T和Th/Ts持续，1.2预示急排；Th/Ts持续表明可能感染，比值1.08，可能性大，0.2应停用免疫抑制剂；•实体肿瘤疗效和病人免疫状态观察治疗前常伴T、Th/Ts，放/化疗有效可恢复；淋巴细胞免疫表型正常或治疗后能恢复正常者预后常较好；•探索疾病发病机理、进程和预后（炎症、肿瘤）临床意义——判断病人的机体免疫状态BDBiosciencesImmuneFunction常见疾病的T淋巴细胞的变化：•`CD4+CD8+CD4+/CD8+•类风湿性关节炎（活动期）•系统性红斑狼疮-或（活动期）•多发性硬化症•重症肌无力•膜型肾小球肾炎•胰岛素依赖性糖尿病•乙型肝炎•自身溶血性贫血•上呼吸道感染BDBiosciencesImmuneFunction常见疾病的T淋巴细胞的变化CD3+CD4+CD8+CD4+/CD8+肿瘤再障及粒细胞减少症巨细胞病毒感染血小板减少活动性特应性皮炎过敏性皮炎BDBiosciencesImmuneFunction淋巴细胞亚群双色分析12%76%49%26%11%BDBiosciencesImmuneFunctionAIDS病人T亚群分析27-51%15-44%50-84%BDBiosciencesImmuneFunction先天性无r球蛋白血症5-18%BDBiosciencesImmuneFunction乳腺癌患者T淋巴细胞亚群变化BDBiosciencesImmuneFunctionTriTEST/MultiTest与T淋巴细胞绝对计数•使用三色试剂或四色免洗试剂•样本使用EDTA抗凝全血，用血量50uL•免洗操作，减少细胞丢失•绝对计数TruCOUNT管预先加有已知数量微球，在流式细胞仪上直接得到T淋巴细胞亚群的绝对含量，提高工作效率和计数的精确度——单平台计数•报告T淋巴细胞及TH、TS百分含量、绝对含量和H/S比值BDBiosciencesImmuneFunctionTriTESTCD4/CD8/CD3分析与T淋巴细胞绝对计数%TLymphCD3+AbsCntCD3+CD4+%TLymphCD3+CD4+AbsCntCD3+CD8+%TLymphCD3+CD8+AbsCntTH/SRatioBDBiosciencesImmuneFunctionMultiTESTCD3/CD8/CD45/CD4MultiTESTCD3/CD15+56/CD45/CD19淋巴细胞活化功能研究BDBiosciencesImmuneFunctionT淋巴细胞活化•细胞数目增殖•细胞表面表达活化标记•分泌细胞因子BDBiosciencesImmuneFunctionCFSE示踪原理•羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(CFSE)是一种可穿透细胞膜的荧光染料，CFSE进入细胞后可以不可逆地与细胞内的氨基结合偶联到细胞蛋白质上。当细胞分裂时，CFsE标记荧光可平均分配至两个子代细胞中，因此其荧光强度是亲代细胞的一半。这样，在一个增殖的细胞群中，各连续代细胞的荧光强度呈对递减，利用流式细胞仪在488nm激发光和荧光检测通道可对其进行分析。•体内、体外实验均可以应用BDBiosciencesImmuneFunctionDilutionofCFSEwithcelldivisionLyonsandParish,1994JIM,171;131Divisions:3210CFSEFL-1(Log)Divisions:3210BDBiosciencesImmuneFunction•葡萄球菌肠毒素刺激牛时间变化示意图，BDBiosciencesImmuneFunctionT淋巴细胞活化•细胞数目增殖•细胞表面表达活化标记•分泌细胞因子BDBiosciencesImmuneFunctionT细胞激活抗原表达的动力学曲线FastImmuneAssaySystem快速全面检测淋巴细胞功能BDBiosciencesImmuneFunctionBDFastImmuneActivationSystem快速免疫活化检测系统lymphocyteActivation4hStain15minLyse/Fix15minAcqusitionerythrocytestimulusBDBiosciencesImmuneFunction优点快速全程5h简便●全血分析（肝素钠抗凝血）●无需分离PBMCs●无需组织培养●免洗试剂，无需洗涤离心高效●多参数分析加速研究进程●功能活性检测同时报告单个细胞亚型可外延●T细胞分析可进行亚群分析●可外延于B、NK、单核细胞接近生物体自身分析条件●应用全血保留了细胞与生化微环境●更能代表体内状态BDFastImmuneActivationSystem快速免疫活化检测系统BDBiosciencesImmuneFunction应用实例：HIV病例T细胞活化检测BDBiosciencesImmuneFunction淋巴细胞活化功能检测的广泛应用结合淋巴细胞亚群分析——•免疫调节:•病因学研究:AIDS、感染、肿瘤、自身免疫性疾病•药物筛选/疫苗疗效评价•各种状态下免疫状态评价：移植、寄生虫、营养失调、创伤、手术、烧伤、放/化疗等BDBiosciencesImmuneFunctionT细胞的细胞因子分型Ⅰ型介导细胞免疫反应引起迟发过敏反应、巨噬细胞活化、2型反应下调刺激来源：病毒、某些细菌Ⅱ型介导体液免疫反应引起B细胞增殖、分泌多克隆免疫球蛋白、1型反应下调刺激来源：多细胞寄生虫、过敏源BDBiosciencesImmuneFunction细胞因子相关的主要研究领