聚谷氨酸

聚谷氨酸的发酵生产和分离提取的工艺研究课题背景及目的意义菌种的分离与发酵产物的提取与鉴定菌种的鉴定目录CONTENTS01PARTONE课题背景及目的意义聚谷氨酸的发现，结构特性及其应用γ-PGA最早发现于1937年，研究人员在炭疽芽孢杆菌（Bacillusanthracis）的细胞荚膜以及糖化菌（Bacillusmesentericus）的细胞荚膜中发现γ-PGA。之后在枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis)以及纳豆杆菌（Bacillusnatto)中也发现了γ-PGA。γ-PGA聚谷氨酸是一种特殊的阴离子自然聚物，是L-Glu和D-Glu以α-氨基和γ-羧基之间经酰胺键的形式缩合而成的高分子聚合物。γ-PGA的分子量一般在50kDa到2000kDa（100~1000kDa）。其保湿锁水功效是透明质酸的500倍聚谷氨酸（γ-PGA）简介poly-γ-glutamicacid土壤级聚谷氨酸聚谷氨酸水胶A对人体和环境无毒可生物降解，生态友好型C水溶性，可得到无味清洁透明的溶液B易交联形成后期拥有卓越性能的水凝胶D可制成钠，钙，镁，氢型γ-PGA的特性01增加抗冻性，食品冷藏增加抗溶性增加钙及其他矿物质吸收抗氧化食品方面03保健品添加剂，促进钙质吸收具有良好的生物亲和性和生物降解性，可用作药物载体医药方面02作为植物增产营养素超强亲水性与保水能力，可作为肥料增效剂，并增加植物抗病能力平衡土壤酸碱度可结合沉淀有毒重金属农业方面04污水处理，如重金属吸收剂或螯合剂卫生用品，婴儿尿布及妇女卫生巾等保湿作用，用于化妆品其他方面γ-PGA的应用02PARTTWO菌种的分离与发酵产γ-PGA的菌株，菌种的筛选，培养基L-Glu依赖型这类菌种主要有B.anthracis、B.subtilisMR-141、B.licheniformisATCC9945、B.licheniformisATCC9945a、B.subtilisIFO3335、B.subtilisF-2-01和Madla和Prasertsan等[9]从温泉中筛选出的B.thrmotolerantWD90.KT12.KF.41等非L-Glu依赖型这类菌种主要有B.subtilis5E、B.subtilisvar.polyglutamicum、B.licheni-formisA35、B.subtilisTAM-4等。产γ-PGA的菌株能发酵生产γ-聚谷氨酸的菌种较多，有地衣杆菌、枯草芽孢杆菌等菌种，而以枯草芽孢杆菌发酵生产γ-PGA的研究居多。根据细胞生长的营养要求是否需要L-谷氨酸可以把γ-PGA产生菌分为两大类①B.licheniformis9945a发酵生产γ-聚谷氨酸1942年发现B.licheniformis9945a能够生产γ-PGA，接着相关培养基设计和发酵条件优化的研究相继展开。研究表明，盐浓度、L-Glu、甘油和柠檬酸是生产γ-PGA的主要影响因素，Mn2+和Ca2+对γ-PGA的产生也有显著影响。最优培养基组成如下：柠檬酸12g/L，甘油80g/L，NH4Cl7g/L，MgSO40.5g/L，FeCl30.04g/L，K2HPO40.5g/L，pH=7.4。2～3天培养后，γ-PGA的产量为15g/L。B.licheniformis9945a在此培养条件下，产量较低，可能是由于没有找到最适的碳氮源、生长因子等。在随后的研究中，产量高于15g/L。②B.subtilisIFO3335发酵生产γ-聚谷氨酸B.subtilisIFO3335是从一种传统的日本食品“纳豆”中分离出来的，是一种L-Glu依赖型菌株。外源的L-Glu仅仅是作为γ-PGA合成酶的激活剂，而用于合成γ-PGA的谷氨酸则是TCA循环的中间代谢物。利用这种细菌发酵生产γ-PGA，产量随培养条件的不同而不同，其范围为20～50g/L。典型的培养基组成为：L-Glu30g/L，柠檬酸20g/L，硫酸铵5g/L，培养周期96h。这个菌株以外源的L-Glu作为合成γ-PGA的激活剂，而合成γ-PGA的主要前体来源于TCA循环，因此，可以尝试直接加入TCA循环中间代谢物，考察γ-PGA的产量，选出最佳前体添加物，以进一步提高产量。③B.subtilisZJU-7发酵生产γ-聚谷氨酸B.subtilisZJU-7是从中国传统食品豆腐乳中分离出来的，是一种L-Glu依赖型菌株，发酵生产γ-PGA时必须加入外源谷氨酸。其最适碳源和氮源分别是蔗糖和胰蛋白胨，在含有60g/L蔗糖、60g/L胰蛋白胨和80g/LL-Glu的培养液中37℃培养24h后，γ-PGA的产量为54.4g/L。这是目前（2008年）报道过的最高产量。然而，考虑到工业化生产，营养成本较高，生产成本也随之提高。因此，利用农副产品或者含有L-Glu的各种废料生产γ-PGA，降低其生产成本后，有望工业化。菌种的筛选初筛取实验材料2g于10mL无菌水的试管中，用橡胶塞封口，振荡2min,再静置30min；水浴锅100℃煮沸5min；冷却后，取上清液1mL，浓度梯度稀释，分别取0.2mL稀释液涂布于初筛培养基平板上；37℃培养24h观察结果，在初筛培养基上挑选呈粘液状能拉丝的单菌落，将筛选出的单菌落经划线分纯后分别编号，并进行3代传代培养；最后于枯草芽孢杆菌转接于LB斜面，再经培养有保存于冰箱中（4℃）。实验材料：土壤纳豆豆腐乳豆豉菌种的筛选复筛制备液体种子培养基并灭菌，分别从保藏的新鲜斜面上取一至两环菌接入种子培养基（50mL/150mL锥形瓶），37℃、150r/min24h。按2%的接种量，分别将种子液接到装有120ml灭菌基本发酵培养基中，37℃150r/min96h.菌种保存方法短期LB培养基斜面，4℃保存3个月转一次长期0.5mL菌悬液（108个/mL）与0.5mL40%灭菌甘油混匀-80℃，可保存2年。培养基初筛培养基及斜面保存培养基（LB）：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，琼脂15-20g/L，NaOH调pH至7.2,121℃蒸汽灭菌20min.液体种子培养基：LB培养基中加入1g/L的葡萄糖基本发酵培养基：柠檬酸10g/L，L-Glu15g/L，NH4Cl4g/L，K2HPO4·3H2O1g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，FeCl3·6H2O0.02g/L，CaCl2·2H2O0.2g/L，去离子水配制后，用NaOH调pH至7.5,121℃20min。03PARTTHREE产物的提取与鉴定γ-PGA的提取及鉴定复筛菌株的发酵液经离心除菌后,取上清液,加入4倍于上清液体积的乙醇,搅动后于6000r/min离心20min,收集沉淀物。沉淀物用适量去离子水溶解,加入4倍于其体积的乙醇沉淀,此沉淀物用pH6.98的磷酸氢二钠磷酸二氢钾缓冲液溶解后,加入5倍于其体积、预冷的丙酮,6000r/min离心20min。将沉淀物倒入截留分子质量8～12ku的透析袋透析40min,换水2～3次,冷冻干燥得检测样品。HPLC分析产物成分分析紫外扫描光谱分析（200～600nm扫描）HPLC分析SDS-PAGE测定分子量提取8株目标菌株的摇瓶发酵产物,进行紫外扫描,发现B53菌株的发酵产物最大吸收波长为212nm,并且只有1个峰(图1),与聚谷氨酸的典型紫外吸收波长非常接近(214nm),于是确定B53菌株为下一步研究的出发菌株。该物质在260～280nm没有吸收峰,表明其没有典型的肽链结构。对B53纯化产物常规盐酸水解后,再经处理进行液相色谱分析(图2)。其中左侧第1个峰为内标物即牛磺酸(出峰时间5.74min);第3个为溶剂峰即FMOC(出峰时间27.26min),可见此聚合物的水解产物只含有1种氨基酸;第2个峰(出峰时间9.74min)与谷氨酸的出峰时间相同,推断此水解物为谷氨酸。采用SDS-PAGE变性电泳检测到B53产生的聚谷氨酸的分子质量570～669ku,呈多分子质量分子聚集体形式,并非由单一分子质量组成(图3)04PARTFOUR菌种鉴定菌体形态，16SrDNA序列的测定及系统发育树的建立主要从以下几个方面①菌落：颜色，形状，表面是否光滑，边缘是否平整；②菌体：大小，有无鞭毛芽孢荚膜等结构；③革兰氏染色16SrDNA序列的测定和系统发育树的建立细菌菌株基因组DNA的提取：用基因组DNA提纯试剂盒提取16SrRNA基因序列的PCR反应16SrRNA基因序列测定同源性分析，系统发育树的建立