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第三章酶工程及其在食品工业中的应用酶的概念•目前将生物催化剂分为两类酶、核酶（脱氧核酶）酶是一类由活细胞产生的，对其特异底物具有高效催化作用的蛋白质。酶学研究简史•公元前两千多年，我国已有酿酒记载。•一百余年前，Pasteur认为发酵是酵母细胞生命活动的结果。•1877年，Kuhne首次提出Enzyme一词。•1897年，Buchner兄弟用不含细胞的酵母提取液，实现了发酵。•1926年，Sumner首次从刀豆中提纯出脲酶结晶。•1982年，Cech首次发现RNA也具有酶的催化活性，提出核酶(ribozyme)的概念。•1995年，JackW.Szostak研究室首先报道了具有DNA连接酶活性DNA片段，称为脱氧核酶(deoxyribozyme)。酶与生命活动密切相关所有生命活动或过程都需要酶的参与（1）执行具体生理机能（2）降解大分子（3）协同激素起信号转化、传递、放大作用（4）催化代谢反应酶的组成和分布是生物进化与组织功能分化的基础在生物进化过程中形成了从酶的合成到酶的结构和活性各种水平的调节机构。第一部分酶的分子结构与功能TheMolecularStructureandFunctionofEnzyme（一）结构组成仅含氨基酸组分的酶称为单纯酶有些酶其分子结构仅由氨基酸组成，没有辅助因子。这类酶称为单纯酶（simpleenzyme）。如脲酶、一些蛋白酶、淀粉酶、酯酶和核糖核酸酶等。一、酶的分子组成（二）结构组成中既含氨基酸组分又含非氨基酸组分的酶称为结合酶结合酶（conjugatedenzyme）是除了在其组成中含有由氨基酸组成的蛋白质部分外，还含有非蛋白质部分蛋白质部分：酶蛋白(apoenzyme)辅助因子(cofactor)金属离子小分子有机化合物全酶(holoenzyme)决定反应的特异性及其催化机制决定反应的性质和反应类型辅助因子分类（按其与酶蛋白结合的紧密程度）辅酶(coenzyme):与酶蛋白结合疏松，可用透析或超滤的方法除去。辅基(prostheticgroup):与酶蛋白结合紧密，不能用透析或超滤的方法除去。二、酶的活性中心必需基团(essentialgroup)酶分子中氨基酸残基侧链的化学基团中，一些与酶活性密切相关的化学基团。常见的必需基团Ser-OHHis-咪唑基Cys-SHAsp、Glu-COOH或称活性部位(activesite)，指必需基团在空间结构上彼此靠近，组成具有特定空间结构的区域，能与底物特异结合并将底物转化为产物。酶的活性中心(activecenter)活性中心内的必需基团结合基团(bindinggroup)与底物相结合催化基团(catalyticgroup)催化底物转变成产物位于活性中心以外，维持酶活性中心应有的空间构象所必需。活性中心外的必需基团底物活性中心以外的必需基团结合基团催化基团活性中心酶的催化特性1、与一般催化剂的共性2、作为生物催化剂的特性1、与一般催化剂的共性（1）用量少；效率高；反应前后质和量不变（2）加速化学反应的速度，不改变反应的平衡点(3)不能够触发热力学上不能进行的反应。（4）催化可逆反应的酶对正反应、逆反应都有催化作用（5）降低反应的活化能。（一）高度的催化效率（二）高度的特异性（三）可调节性2、作为生物催化剂的特性二．酶的分类：•1．氧化还原酶•2．转移酶•3．水解酶•4．裂合酶•5．异构酶•6．连接酶（合成酶）•7．核酸酶（催化核酸）1．氧化还原酶(Oxidoreductase)•包括脱氢酶(Dehydrogenase)、氧化酶(Oxidase)、过氧化物酶、氧合酶、细胞色素氧化酶等2．转移酶(Transferase)•包括酮醛基转移酶、酰基转移酶、糖苷基转移酶、含氮基转移酶等CH3CHCOOHNH2HOOCCH2CH2CCOOHOHOOCCH2CH2CHCOOHNH2CH3CCOOHO3．水解酶(Hydrolase)•脂肪酶、糖苷酶、肽酶等，水解酶一般不需辅酶H2OCOOCH2CH3RRCOOHCH3CH2OH4．裂合酶(Lyase)•这类酶可脱去底物上某一基团留下双键，或可相反地在双键处加入某一基团。5．异构酶(Isomerase)•此类酶为生物代谢需要对某些物质进行分子异构化，分别进行外消旋、差向异构、顺反异构等6．连接酶（合成酶）•这类酶关系很多生命物质的合成，其特点是需要三磷酸腺苷等高能磷酸酯作为结合能源，有的还需金属离子辅助因子。分别形成C-O键（与蛋白质合成有关）、C-S键（与脂肪酸合成有关）、C-C键和磷酸酯键。7.核酸酶（催化核酸）•核酸酶是唯一的非蛋白酶。它是一类特殊的RNA，能够催化RNA分子中的磷酸酯键的水解及其逆反应。酶用于生物催化的概况类别占总酶比例%利用率%水解酶hydrolases2665氧化还原酶oxidoreductases2725转移酶transferases245裂合酶lyases12~5异构酶isomerases5~1连接酶ligases6~1酶与底物的结合模型•a．锁和钥匙模型•b．诱导锲合模型2关于酶与底物分子结合的假说（1）.中间络合物学说：底物先与酶结合成不稳定的中间络合物，然后再分解释放出酶与底物证实：H2O2+过氧化物酶（H2O2—过氧化物酶）（褐色）（红色）645\587\548\498nm561\550nm（H2O2—过氧化物酶）+AH2过氧化物酶+A+2H2O（红色）（褐色）（2）锁－钥匙学说：1890年Fisher提出。该学说认为酶的天然构象是刚性的，如果底物分子结构上存在着微小的差别，就不能契入酶分子中，从而不能被酶催化。（3）诱导－契合假说:Koshland提出当酶分子与底物接近时，酶蛋白受底物分子的诱导，其构象发生了有利于底物结合的变化，酶与底物在此基础上互补楔合，进行反应。第二部分酶工程概述一、酶工程的概念酶工程:酶的大批量生产以及利用酶的催化作用,借助工程技术手段进行物质转化,生产人们所需要产品的技术。酶工程与发酵工程、基因工程、细胞工程的关系二、酶工程的内容根据酶工程研究和解决问题的手段不同，将酶工程分为化学酶工程和生物酶工程。（一）化学酶工程亦称初级酶工程，指自然酶、化学修饰酶、固定化酶及化学人工酶的研究和应用。（二）生物酶工程生物酶工程主要包括三个方面：一是用基因工程技术大量生产酶(克隆酶)，二是修饰酶基因产生遗传修饰酶(突变酶)，三是设计新酶基因，合成自然界不曾有的酶(新酶)当前酶工程的主要任务是：研制分解纤维素和木质素的酶、使低分子有机物聚合的酶、检测用酶、能分解有毒物质的酶及废物综合利用酶。利用基因工程技术开发新酶品种和提高酶产量。固定化酶和细胞、固定化多酶体系及辅因子再生体系，特定生物反应的研究和应用。用微生物和动植物组织研究生物传感器。非水系统的反应技术，酶分子的修饰与改造以及酶型高效催化剂的人工合成研究。第三部分食品酶的生产与分离纯化一、酶的生产获得酶制剂的方法有:化学合成从生物体内直接提取分离目前酶的生产主要以微生物为原料。（一）对酶生产菌的要求1、不能是致病菌。可用于食品的有枯草芽孢杆菌、黑曲霉、米曲霉、啤酒酵母等2、不易退化，不易感染噬菌体。3、产酶量高，而且最好产生胞外酶。4、能利用廉价的原料，发酵周期短，易培养。生产菌种的获得:除了从菌种保存机构和有关部门获得外，一般都有要通过筛选得到。筛选包括：菌样采集、菌种分离、纯化和生产性能检定。（三）提高酶产量的方法在正常情况下，酶产量受其合成调节机制的调控，因此要提高酶产量就必须打破这种调控机制。酶合成调节控制能保证机体最经济有效地将体内原料和能量用于合成生命活动最需要的物质，但是人们为了需要使某些酶大量合成就必须打破这种调节机构。1、通过条件控制提高酶产量(1)添加诱导物:这种方法只适应于诱导酶的合成。其关键在于选择适宜的诱导物及其浓度。诱导物：一是酶的作用底物，但有些底物并不一定是诱导物；二是一些难以代谢的底物类似物。三是诱导物的前体物质。此外,对于参加分解代谢的胞外酶，它们的产物也往往行诱导作用，如纤维二糖诱导纤维素酶。(2)降低阻遏物浓度:对于受分解代谢产物阻遏的酶，常采用直接限制碳源或相应的生长因子供应。对于合成代谢的酶解决尾产物阻遏的方法在培养基中添加尾产物类似物或尾产物形成的抑制剂采用营养缺陷型菌株，限制其必须生长因子的供应阻遏有两种：分解代谢产物阻遏、尾产物阻遏分解代谢产物阻遏：当细胞在容易利用的碳源（葡萄糖）上生长时，有些酶特别是参与代谢的酶类的合成受阻。尾产物阻遏：有些酶当它们的作用产物积累到一定浓度，并满足集体需要后，其合成就受阻。2、通过基因突变提高酶产量根据酶合成的调节机构，要使酶产量因基因突变而提高，有两种可能：一是使诱导型变成组成型：即获得的突变株在没有诱导物存在的条件下酶产量达诱导的水平；二是使阻遏型变为去阻遏型：即获得的突变株在引起阻遏的条件下，酶产量达到无阻遏的水平。方法：物理：紫外线、X-射线化学：5-溴代尿嘧啶、亚硝酸等基因突变？基因重组？3、其他提高酶产量的方法(1)添加表面活性剂：人们发现许多表面活性剂能提高酶的产量，特别有利于霉菌胞外酶的生产，而且它们对菌和酶没有专一性，通常用的是非离子型表面活性剂如Tween80、TritomX-100等。目前认为，表面活性剂可能是提高了细胞膜的透性，有助于打破细胞内酶合成的“反馈平衡”。(2)其他产酶促进剂：有时添加其他一些物质也能提高酶的产量。如枯青霉培养基中添加植酸钙镁，可使5’-P-二酯酶产量增加10-20倍。(3)通过基因重组提高酶的产量：二、酶的分离纯化（P37）酶的分离纯化包括三个基本的环节：抽提：即把酶从材料转入溶剂中制成酶溶液；纯化：即把杂质从酶溶液中除掉或从酶溶液中把酶分离出来；制剂：即将酶制成各种剂型。三、酶与细胞固定化从20世纪60年代起，固定化酶研究的发展很快。初期，人们集中于各种制备方法的研究，近年，人们的注意力已开始转向固定化酶和固定化细胞在工业、医学、化学分析、亲和层析和环境保护、能源开发以及理论研究等方面的应用研究。固定化酶：指经过一定改造后被限制在一定的空间内，能模拟体内酶的作用方式，并可反复连续地进行有效催化反应的酶。固定化酶又称固相酶。固定化技术：是通过化学或物理等手段将酶分子束缚起来供重复使用的技术（一）为什么要固定化酶（二）酶固定化的优缺点（三）酶的固定化方法（四）固定化酶反应器（一）为什么要固定化酶传统酶（自由酶）催化反应存在如下缺点①传统酶催化反应几乎都在水溶液中进行，只能一次性使用，难以回收②酶与产物混合，增加产物分离和纯化难度③溶液中酶的稳定性差，容易变形和失活。而将酶固定化能够克服这些缺点。相对于酶直接加入至溶液中，通常将固定化酶的制备过程称为酶的固定化。该项技术于20世纪60年代发展起来的，1971年第一届国际酶工程会议正式建议采用固定化酶的名称。（二）酶固定化的优缺点1、酶固定化的优点：固定化酶最大的特点就是既有生物催化剂的功能，又有固相催化剂的特点：①可以重复使用，在大多数情况下，稳定性明显提高②催化后，酶与底物容易分开，产物易于分离纯化，质量提高③反应条件易于控制，可实现反应的连续化和自动控制④酶的利用效率高了，单位酶量催化的底物浓度增加，而酶量减少⑤更适合于多酶催化反应2、固定化酶的缺点①存在着酶失活现象，尤其是共价法固定②消耗固定化材料，增加成本③酶被固定到载体后将增加底物和产物的传质阻力以此，考虑固定化酶的优缺点，在工业采用固定化还是液态的，应该根据具体情况分析而定。1、酶的固定方法酶的固定方法有四种：吸附法共价键结合法交联法包埋法（一）吸附法吸附法分为物理吸附法和离子吸附法。1、物理吸附法通过氢键等物理作用，将酶固定在水不溶载体上的方法。常用的载体无机吸附剂：如高岭土、硅藻土、硅胶、磷酸钙胶、微孔玻璃等。无机吸附剂吸附容量低，一般小于1mg蛋白/g吸附剂，还易发生解吸。有机吸附剂：如纤维素、骨胶原、赛璐玢、火棉胶等。吸附容量可达70mg蛋白/cm2膜。物理吸附法制成的固定化酶，酶活力损失少，但酶易脱落，实用