离子交换层析

生物技术综合实验Comprehensiveexperimentsofbiotechnology主要内容Contents：一、课程简介核酸的分离与纯化IsolationandPurificationofNucleicAcid二、电泳技术AgaroseGelElrctrophoresisandSDS-PAGE三、聚合酶链式反应技术PolymeraseChainReaction四、DNA序列测定DNASequencing五、分子杂交技术MolecularHybridization－Southern,NorthernandWesternBlot六、基因文库和cDNA文库的构建ConstructionofcDNALibraryandDNALibrary七、外源基因的克隆与表达HeterogenicGeneCloningandExpression八、蛋白质的分离、纯化技术IsolationandPurificationofProtein1表达蛋白质的分离沉淀蛋白质分离收集菌体洗涤破碎细胞等电沉淀盐析沉淀高分子物质分级沉淀超声破碎化学法溶菌酶上清液培养基1.1凝胶过滤层析凝胶过滤又叫分子筛层析，其原因是凝胶小球具有网状结构，小分子物质能进入其内部，而大分子物质却被排除在外部。当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同分子量筛分开了。凝胶过滤层析柱胶球大小-介质离子粗细影响流动(1)胶球颗粒有一定大小，一般可分为corse,medium,fine,superfine四种粗细(grade)；越粗的胶体，流率越好，但分辨率越差。因胶球外面的缓冲液是由胶球表面向内扩散，样本蛋白质也是以扩散方式进入胶球，再由中心向外扩散出来。胶球半径越大，扩散距离越大，效果越差。(2)下图说明这种扩散介质的机制。而近年来因材料科学的进步，发展出通透性特强的胶球，缓冲液可直接浸润而进入胶球，不需经过扩散作用，是为dispersion弥散式的胶体，效果较好且快速。商品化称为perfusionchromatography。胶球大小-介质离子粗细影响流动二、离子交换层析离子交换层析是在以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的。离子交换剂是由基质、电荷基团和反离子构成的。离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行，或借助离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行。两大类离子交换介质由介质带电基团的不同，可分为两大类：介质－带电基团(counterion)(1)阳离子交换介质(cationexchanger)：载体-阴离子基团.....阳离子(2)阴离子交换介质(anionexchanger)：载体-阳离子基团.....阴离子阳离子：两价阳离子NH4+K+Na+H+Li+阴离子：I-Br-Cl-HCO3-CH3COO-,OH-四、亲和层析亲和层析的原理与众所周知的抗原一抗体、激素一受体和酶一底物等特异性反应的机理相类似，每对反应物之间都有一定的亲和力。在亲和层析中是特异的配体才能和一定的生命大分子之间具有亲和力，并产生复合物。实质上亲和层析是把具有识别能力的配体L（对酶的配体可以是类似底物、抑制剂或辅基等）以共价键的方式固化到含有活化基团的基质M（如活化琼脂糖等）上，制成亲和吸附剂M－L，或者叫做固相载体。而固化后的配体仍保持束缚特异物质的能力。特异性配体亲和层析法与通用性配体亲和层析法特异性配体亲和层析法：配体一般为复杂的生命大分子物质（如抗体、受体和酶的类似底物等），它具有较强的吸附选择性和较大的结合力。通用性配体亲和层析法：配体则一般为简单的小分子物质（如金属、染料，以及氨基酸等），它成本低廉、具有较高的吸附容量，通过改善吸附和脱附条件可提高层析的分辨率。金属螯合亲和层析a.许多蛋白分子上带有金属离子，则此蛋白质可能会吸附该金属。b.若把某金属固定到固相载体上，则此载体将会专一性地吸附需要此金属的蛋白质。c.基因操作时，经常在表达蛋白质的末端加上一段含有六个His的片段；则此表达蛋白质，可以吸附到含有镍的吸著剂上，可以用咪唑流洗出来。d.这种载体上结合有某些可与金属产生配位键的基团(如nitrilotriaceticacid)，这些基团与金属离子结合(如镍离子)后，即可成为亲和吸附剂。疏水性层析法(1)蛋白质分子表面有部份疏水性区域，若在一极性很强的环境中，则会被吸附在非极性的固定相载体上；若环境的极性降低，则可被洗脱出来，即为疏水性层析法(hydrophobicinteractionchromatography,HIC)。(2)HIC没有亲和层析析法那么强的专一性，较似离子交换法，但所根据的作用力，则是非极性基团间的疏水性引力。反相层析法(1)是HIC及离子交换法的综合体，但属于一种partition层析；可使用离子交换(或类似HIC)的介质。(2)混合极性及非极性溶液为流动相，当流动相通入介质后，介质表面可固定其中的极性溶液(若使用HIC介质则固定非极性者)，样本分子会在此二相中进行partition分离。(3)因固定相及流动相的极性刚好相反，故名reversephase。离子交换层析树脂材质疏水性：聚苯乙烯-苯二乙烯亲水性：纤维素（cellulose）、葡聚糖凝胶（Sephadexgel）和琼脂糖凝胶（Sepharose）特性是具有亲水性和较大的表面积，对生物活性物质而言，是一个较为温和的环境，同時也是大分子所适用的分离纯化材质离子交换剂的选择保持欲分离物质的生物活性。已知等电点的物质，在高於等电点的pH条件下，因帶有负电荷，应采用阴离子子交換，在低於等电点的pH下，則采用阳离子交換。未知等電點的物質，在一定pH條件下進行電泳，向陽極移動較快的物質，在同樣條件下可被陰離子交換劑吸附，向陰極移動較快的物質可被陽離子交換劑吸附。緩衝液的選擇緩衝液離子以不干擾分離物活性測定、不影響待測物溶解度、不發生沉澱為原則；使用陰離子交換纖維時要選用低於交換劑離子pK值的緩衝液，若欲分離的物質屬於酸性，則緩衝液的pH值要高於該物的等电点；用陽離子交換纖維時要選用高於pK值的緩衝液，目的物屬於鹼性物質的話，緩衝液要低於該物等電點的pH值。所使用的緩衝液pH只要比樣本蛋白質的pI稍高或低1pH單位即可。DonnanEffect與pH變化離子交換介質表面的微環境會比緩衝液高或低一個pH單位。離子交換樹脂的前處理離子交換樹脂使用前，先以蒸餾水除去其內之雜質，並以NaOH和HCl處理樹脂，使其上的官能基完全露出。再以水清洗至pH7.0，最後用欲使用的緩衝液浸泡。(1)離子交換介質與蛋白質的結合量有一定限度，稱為該交換介質的容量(capacity)；若超過此一容量，多出的樣本會直接流出。(2)交換介質的結合容量大小，受層析條件不同、蛋白質種類不同、緩衝液不同、pH或離子濃度不同等，有很大的差異。如DEAE-SepharoseCL-6B每100mL可結合11克白蛋白，但對ferritin只有0.4克。介質容量有限可用pH或盐梯度洗脱方式有：连续梯度(continuousgradient)及阶段梯度(stepwisegradient)。洗脱离子交换法操作要点1胶体平衡：用过的胶体要再生完全平衡在缓冲液中；2洗脱方式：通常都以氯化钠进行连续梯度洗脱；3浓度体积：高低限洗脱液的浓度及体积离子交换层析的应用制备、纯化生命物质测定蛋白质等电点凝胶过滤层析凝胶的分类1）葡聚糖凝胶2）琼脂糖凝胶3）聚丙烯酰胺凝胶凝胶过滤法的应用脱盐和浓缩分离生命物质去热源物质（糖蛋白）测定分子量亲和层析亲和层析法基质的选择理想基质：1）极低的非特异吸附性；2）高度亲水性3）较好的理化稳定性4）具有大量化学基团，能有效活化，易和配体结合；5）具有适当的多孔性纤维素、聚丙烯酰胺、交联葡聚糖、琼脂糖、交联琼脂糖、多孔性玻璃珠；用在蛋白質，仍以聚糖類為最佳。以Sepharose為例，可自行用CNBr活化，使糖分子接上-O-C≡N(cyanateester)基，再與配体上的胺基反應。有些親和層析法使用spacerarm來降低配体的立体障礙影响亲和层析的因素样品体积和流速温度親和層析法的應用1.核酸的純化：單股DNA與纖維素（cellulose）組合的凝膠，已成為分離mRNA的重要方法之一將單股DNA接在Sepharose上，純化DNA聚合酶或RNA聚合酶。2.激素受體（receptor）的純化3.抗體與抗原的純化4.酶和酶的抑制劑純化液相柱层析总结介質粒子越細，色析法的解析力就越佳，但流動相的流速也就越慢。流速太慢反而會導致解析力變差。