荧光定量PCR技术专题

TIANGENBIOTECH(BEIJING)CO.,LTD―qPCR系统“从RNA提取到荧光定量PCR”解决方案内容概要荧光定量PCR的原理荧光定量PCR的标记方法荧光定量PCR解析方法SYBR法实验流程及注意事项TIANGEN公司荧光定量产品选择指南实时定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析与常规PCR技术比较：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析，无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测荧光定量PCR原理－－定义扩增曲线荧光阈值Ct值荧光定量PCR原理－－常用名词概念Cycle（循环数）Rn（荧光强度）BaselineLg－linerphase平台期荧光基团荧光检测元件荧光定量PCR原理－－扩增曲线Cycle（循环数）Rn（荧光强度）BaselineLg－linerphase前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline）荧光阈值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍手动设置：大于荧光背景值和阴性对照的荧光最高值；进入指数期的最初阶段真正的信号:荧光信号超过阈值Threshold荧光定量PCR原理－－荧光阈值平台期Ct值的定义：PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数Cycle（循环数）Rn（荧光强度）Ctvalue荧光定量PCR原理－－Ct值横轴：PCR反映循环数纵轴：荧光信号量Ct值的特点：相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定；Ct值极具重现性Ct值的重现性理想的PCR反应Xn＝X02n*Xn：第n次循环后扩增产物数量X0：起始模板数量n：扩增循环数荧光定量PCR原理－－Ct值定量的数学原理非理想的PCR反应Xn＝X0（1＋En）n*Xn：第n次循环后扩增产物数量X0：起始模板数量n：扩增循环数En：扩增效率荧光定量PCR原理－－Ct值定量的数学原理在扩增产物达到荧光阈值时XCt＝X0（1＋En）Ct＝M（1）*XCt：荧光扩增信号达到阈值时扩增产物的量，在阈值设定以后，它是一个常数，定为M方程式（1）两边同取对数得：Log2M＝Log2X0*（1＋En）Ct（2）整理方程式（2）：Log2X0＝Log2M－CtLog2（1＋En）荧光定量PCR原理－－Ct值定量的数学原理CyclenumberCk104Ck102SampleLgofDNAconcentration模板DNA量越多，荧光达到阈值的循环数越少，即Ct值越小。Log模板起始浓度与Ct值呈线性关系。荧光定量PCR原理－－Ct值与模板起始量的关系线性关系、扩增效率确认检测灵敏度确认Notemplatecontrol确认标准曲线斜率:-3－-3.535Cycles内可得到好的定量结果如果采用SYBR检测方法，30Cycles内无非特异性产物扩增35Cycles内无引物二聚体产生相关系数（R2）：大于0.98荧光定量PCR反应性的确认PCR扩增效率（E）:0.9-1.2内容概要荧光定量PCR的原理荧光定量PCR的标记方法荧光定量PCR解析方法SYBR法实验流程及注意事项TIANGEN公司荧光定量产品选择指南非特异性荧光标记SYBRGreenI特异性荧光标记TaqManProbe常用荧光标记方法SYBRGreenI染料法——原理SYBRGreenI是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。SYBRGreenI热变性引物退火延伸反应SYBRGreenI染料法——作用机理问题点：SYBRGreenI与双链DNA进行结合后散发荧光，因此如果反应体系中有非特异性扩增或引物二聚体的产生，也将同时被检测，从而可能导致检测结果不准确。SYBRGreenI染料法——问题点与关键点关键点：设计合适引物，防止非特异性扩增！将温度与荧光强度的变化求导(-dI/dT)原始图谱对数图谱SYBRGreenI染料法——融解曲线融解曲线分析，单一峰无非特异性荧光定量准确融解曲线分析，出现杂峰其他产物出现非特异性荧光，因此定量不准确SYBRGreenI染料法——融解曲线使用方便，不必设计复杂探针具有价格优势优点无模板特异性对引物特异性要求较高不能进行多重定量灵敏度相对较低缺点SYBRGreenI染料法——优缺点Taqman探针法——原理5′端标记有报告基团(Reporter,R)，如FAM、VIC等3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher,Q)探针完整，R发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与Q分开，发荧光Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针Taqman探针法——工作机理热变性引物和探针与模板退火延伸反应探针报告基团淬灭基团探针DNA聚合酶引物RRRR1、引物、探针的设计：探针Tm为68-70℃，30bp,5’不能有G，G可能会淬灭荧光素，引物尽量靠近探针，扩增片段400bp，引物Tm为59-60℃2、反应参数的确定：一般为：94℃，10-20S60℃，30-60S（Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃最高），也可通过温度梯度优化退火温度3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，最大信号/背景比值引物浓度：100-900nM探针浓度：50-300nM4、其他与常规PCR相同Taqman探针法——PCR体系的建立高度特异性重复性好灵敏度高可进行多重定量优点只适合一个特定的目标委托公司标记，价格较高不易找到本底低的探针缺点Taqman探针法——优缺点标记荧光的发夹探针环与目标序列互补茎由互补配对序列组成环茎荧光素淬灭剂实时荧光定量PCR的分类－－分子信标FRET实时荧光定量PCR的分类－－分子信标高特异性：对目标序列检测SNP最灵敏的试剂之一荧光背景低优点只能用于一个特定目标设计困难价格比较高缺点实时荧光定量PCR的分类－－分子信标几种方法的应用比较方法优点缺点适用范围SYBRGreenI方法适用性广灵敏方便便宜引物要求高易出现非特异性带适合科研中对各种目的基因定量分析，基因表达量的研究，转基因重组动植物的研究TaqMan方法特异性高重复性好价格高只适合特定目标病原体检测，疾病耐药基因研究,药物疗效考核遗传疾病的诊断MolecularBeacon法(分子信标)高特异性荧光背景低只适合特定目标设计困难价格高特定基因分析SNP分析定性分析研究：杂合或纯合子鉴定，（SNPs）分析等绝对定量研究：病毒和病原菌定量分析，基因拷贝数定量，GMO定量检测等相对定量研究：mRNA表达量分析，siRNA效果确认，差异显示结果验证等荧光定量PCR技术的应用内容概要荧光定量PCR的标记方法荧光定量PCR的原理荧光定量PCR解析方法SYBR法实验流程及注意事项TIANGEN公司荧光定量产品选择指南绝对定量解析方法Sample25绝对定量的定义Log（起始浓度）与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,即得到该扩增反应存在的线性关系根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量一个目的基因——即需要确定其量值的核酸序列。一组标准样本——用来生成标准曲线。可以是含有目的基因的质粒、PCR产物、基因组DNA等。重复反应孔–——建议每个样本使用三个或更多重复反应，以确保统计显著性。标记方法的选择——SYBRGreen法或探针法均可。实验结果显示——扩增曲线；标准曲线；融解曲线（探针法不需要）。绝对定量分析几要素质粒标准品的制备PCR目的基因克隆质粒提取，OD值定量，将质粒梯度稀释作为标准品使用目的基因目的基因目的基因质粒目的基因基因组DNA拷贝数的计算：待测样本浓度（ng/ul）＝OD260×40×稀释倍数样本分子量=碱基数×324待测样本拷贝数（copies/ul）=待测样本浓度/样本分子量×6×1014倍比梯度稀释方法：1v原液(标准品i)+9v稀释缓冲液，得标准品ii1v标准品ii+9v稀释缓冲液，得标准品iii1v标准品iii+9v稀释缓冲液，得标准品iv1v标准品iv+9v稀释缓冲液，得标准品v质粒标准品稀释方法与拷贝数计算方法：从血液中提取病毒DNA，以TaqMan探针法进行荧光定量检测试剂：TIANGEN公司探针法试剂RealMasterMix（Probe）（目录号：FP203）标准品：质粒标准品浓度为106、105、104、103；2个重复；设阴性空白对照实验步骤：提取HBVDNA；设计特异引物；设计TaqMan探针并标记探针；荧光定量扩增；结果分析：获取血液样品中HBVDNA的精确copy数。绝对定量实验例——乙肝病人血液中HBV的绝对定量Samplecopies/mlCt1Ct2MeanCtSTD标准品5×10328.1828.6428.410.16标准品5×10425.2525.1425.190.04标准品5×10522.1122.4622.280.12标准品5×10618.6318.9218.770.10未知样品?20.5620.4520.50.05空白对照NoneNone实验数据绝对定量实验例——乙肝病人血液中HBV的绝对定量扩增效率（E）计算E=10-1/斜率－1=10-1/-3.29－1=2.01－1=1.01标准曲线制作：利用MeanCt作图可得到标准曲线y=-3.29x+40.33R2=0.9978绝对定量实验例——乙肝病人血液中HBV的绝对定量相关系数（R2）：大于0.98，越接近1，结果可信度越高。扩增效率（E）：0.9-1.2,越接近1，越理想。未知样品拷贝数的计算将Ct值带入线性方程：20.5=-3.29X+40.33QuantityUnknown=106.03=1,071,519copies绝对定量实验例——乙肝病人血液中HBV的绝对定量X=20.5-40.33-3.29=6.03相对定量解析方法理论上目的基因表达量分析条件SampleBSampleA目的基因扩增效率相同RNA提取效率相同细胞起始数相同实际目的基因表达量分析相对定量的必要性相对定量分析方法比较两个或两个以上样本中某个基因表达量的变化！关注点：基因的相对表达量，而不是基因的绝对量！一个参照样本一个或一个以上的未知样本一个目的基因管家基因——用来校对不同样本之间目的基因的实际表达量重复反应孔–——建议每个样本使用三个或更多重复反应，以确保统计显著性。标记方法的选择——SYBRGreen法或探针法均可。实验结果显示——扩增曲线；标准曲线（有些分析方法不需要）；融解曲线（探针法不需要）。一组标准样本（有些分析方法不需要）相对定量分析几要素管家基因维持细胞基本代谢活动所必须的基因,如：GAPDH、Actin、18SrRNA等筛选方法根据文献提供通过具体实验筛选相对定量分析——管家基因筛选0123456Sample1Sample2Sample3Sample4实验组实验值β-ActinGAPDHβ-2-microglobulinHPRTPPPO双标准曲线法2-△△Ct法相对定量分析——两种常用的分析方法通过标准曲线对对照样品、待测样品的目的基因及管家基因进行定量，然后根据计算公式求得相对值即为相对表达量。相对值=校正值=目的基因定量结果管家基因定量结果待测样品的校正值对照样品的校正值相对定量分析——双标准曲线法公式：优点：分析简单，实验优化相对简单缺点：对每一个基因，每一轮实验都必需做标准曲线应用：基因表达调控研究中最常用与公认的两种相对定量方法之一相对定量分析——双标准曲线法检测样品管家基因H目的基因X定量结果定量结果校正值相对量对照样品6391.5343.40.05371.000待测样品18589.717.30.00200.037待测样品27432.91946.10.26184.874实验数据相对定量分析——2法－△△CtXT是目标分子达到设定的阈值时的分子数RT是内参分子达到设定的阈值时的分子数假设目标序列与内参序列扩增效率相同：或最后