总糖的测定-蒽酮比色法

植物组织中总糖和还原糖含量的测定（蒽酮比色法）2010-5-24一、实验目的掌握蒽酮比色法测定总糖和还原糖含量的原理和方法，学会正确使用分光光度计。二、实验原理游离的己糖或多糖中的己糖基、戊糠醛及己糖醛酸在浓硫酸的作用下脱水生成糠醛衍生物，糠醛衍生物与蒽酮缩合成蓝色的化合物，在620nm处有最大吸收，在一定糖浓度范围内（200ug/ml），溶液吸光度值与糖溶液的浓度成线性关系。用酸将植物组织中没有还原性的多糖和寡糖彻底水解成具有还原性的单糖，或直接提取植物组织中的还原糖，即可对植物组织中的总糖和还原糖进行定量测定。三、实验材料1．可见分光光度计、电子天平(1/100)、粉碎机、水浴锅、电炉。2．研钵、量筒、三角烧瓶、烧杯、容量瓶、玻璃漏斗、试管1.5cm×15cm、刻度吸管、胶头滴管、pH试纸、坐标纸。3．植物原料，如银耳、木耳、菜叶等。四、实验试剂1．蒽酮试剂：取2g蒽酮溶于l000ml体积分数为80％的硫酸中，当日配制使用。2．标准葡萄糖溶液(0.1mg／m1)：称取100mg葡萄糖，溶于蒸馏水并稀释至1000ml（可滴加几滴甲苯作防腐剂）。3．6mol／LHCl溶液：50ml盐酸，加水至100ml。4．10％NaOH溶液：称取10gNaOH固体，溶于蒸馏水并稀释至100ml。五、操作步骤1．葡萄糖标准曲线的绘制取干净试管6支，按下表进行操作。以吸光度为纵坐标，各标准液浓度(mg／m1)为横坐标做图。2．样品中还原糖的提取和测定称取植物原料干粉0.1～0.5g，加水约3ml，在研钵中磨成匀浆，转入三角烧瓶中，并用约30ml的蒸馏水冲洗研钵2～3次，洗出液也转入三角烧瓶中。于50℃水浴中保温半小时（使还原糖浸出），取出，冷却后定容至100ml。过滤，取lml滤液进行还原糖的测定：吸取lml总糖类溶液置试管中，浸于冰浴中冷却，再加入4ml蒽酮试剂，沸水浴中准确加热10min，取出用自来水冷却后比色，其他条件与做标准曲线相同，测得的吸光度值由标准曲线查算出样品液的糖含量。（样品液显色后若颜色很深，其吸光度超过标准曲线浓度范围，则应将样品提取液适当稀释后再加蒽酮显色测定）。标准曲线的制作及样品测定参考表管号步骤1#（空白）2#3#4#5#6#7#（样品）8#（样品）标准葡萄糖溶液(ml)00.20.40.60.81.0还原糖总糖蒸馏水(ml)1.00.80.60.40.20样品液(ml)／／／／／／1.01.0糖溶液浓度(mg/ml)00.020.040.060.080.10待测待测置冰水浴中冷却蒽酮试剂(ml)4.04.04.04.04.04.04.04.0沸水浴中准确加热10min，取出，用自来水冷却，室温放置10minA620nm3．样品中总糖的提取、水解和测定称取植物原料干粉0.1～0.5g，加水约3ml，在研钵中磨成匀浆，转入三角烧瓶中，并用约12ml的蒸馏水冲洗研钵2～3次，洗出液也转入三角烧瓶中。再向三角烧瓶中加入6mol/L盐酸10ml，搅拌均匀后在沸水浴中水解半小时，冷却后用10％NaOH溶液中和pH呈中性。然后用蒸馏水定容至100ml，过滤，取滤液10ml，用蒸馏水定容100ml，成稀释1000倍的总糖水解液。取lml总糖水解液，测定其还原糖的含量：吸取lml总糖类溶液置试管中，浸于冰浴中冷却，再加入4ml蒽酮试剂，沸水浴中准确加热10min，取出用自来水冷却后比色，其他条件与做标准曲线相同，测得的吸光度值由标准曲线查算出样品液的糖含量。六、实验结果按照下列公式分别计算植物原料干粉中还原糖和总糖的质量分数（ω）。ω（还原糖）=（C1V1/m）×100％ω（总糖）=（C2V2/m）×0.9①×100％式中ω（还原糖）：还原糖的质量分数（％）；ω（总糖）：总糖的质量分数（％）；C1：还原糖的质量浓度（mg／ml）；C2：水解后还原糖的质量浓度（mg／ml）；V1：样品中还原糖提取液的体积（m1）；V2：样品中总糖提取液的体积（m1）；m：样品质量（mg）。注①：计算总糖含量的公式，在测定干扰杂质很少、还原糖含量相对总糖含量很少时适用，乘0.9是为了从测定出的总糖水解成的单糖量中，扣除水解时所消耗的水量。七、注意事项1．总糖：食品中的总糖通常是指具有还原性的糖（葡萄糖,果糖,乳糖,麦芽糖等）和在测定条件下能水解为还原性单糖的糖的总量。2．本法适用于可溶性还原糖测定。测定结果是还原性糖和能水解为还原性糖的总和。3．如要求结果中不含淀粉，则样品处理不应用高浓度酸，而应改用80%乙醇。4．如提取液中有较多的可溶性蛋白，必须先除去蛋白。5．若样液较深，可用活性碳脱色。