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ASystematicApproachforScale-DownModelDevelopmentandCharacterizationofCommercialCellCultureProcesses皇家药院译摘要：工艺特性鉴定是为了阐明制造工艺的耐用性，主要研究关键操作参数和最终效能之间的关系。特性鉴定研究中的技术信息对于后续的工艺验证至关重要。近几年来这已经成为监管期望。由于进行生产规模的验证研究是几乎不可能的。开发能够代表商业工艺的缩小模型是实现可靠的工艺表征所必须的。在本研究中，我们介绍了一个开发生物反应器缩小模型和表征表达重组蛋白的CHO细胞培养工艺的系统研究方法。首先，我们使用2L反应器在2000L商业规模工艺的基础上开发缩小模型。对比两个规模的细胞生长状况、产量、产品质量、培养环境(pH、DO、pCO2)和代谢水平(葡萄糖、谷氨酰胺、乳酸、氨)，从而限定缩小模型。对关键操作参数进行单因素的范围研究，然后才有建立的缩小模型进行相互作用研究。为了能够成功进行工艺验证及确保工艺性能的一致性，我们将会确定合适的操作范围及某些关键参数的可接受标准。通过相互作用研究鉴别该工艺的最坏条件。简介：在实验室和中试规模完成一个生物制品生产的细胞培养工艺开发之后，将会开启商业化进程，包括工艺表征、放大、技术转移及生产现场的验证。工艺表征需要进行系统研究以详细商业规模细胞培养，主要包括关键操作参数和最终细胞培养性能间的关系，主要为细胞生长、产量以及终产品的质量属性，例如活性、翻译后修饰及杂质概况。工艺表征的目标包括鉴别关键操作和性能参数，建立关键参数的可接受范围，并阐明工艺耐用性。表征研究获得的技术信息近几年已成为监管期望，可以作为制造工艺验证先决条件以及为长期商业化生产提供支持。因为费用较为昂贵且可用的大规模生物反应器有限，所以在生产规模进行表征研究是几乎不可能的，常常在实验室规模采用能够代表生产规模工艺性能的缩小模型。为了计算一致性和准确性，需要在整个表征研究中采用合格的分析方法。细胞培养工艺表征的整体步骤如图1所示，详细步骤将会在底下的文字中进行介绍。风险评估：在开始表征研究之前需要对整个细胞培养工艺潜在的失败风险进行评估，主要包括对培养基配制、种子培养和生产阶段等的进行评估，以对风险的程度进行区分。故障模式与影响分析可以欧威区分操作参数并评估其对过程的潜在影响的系统方法，FMEA是一个实用的分析工具，能够知道工艺评估并确定哪些操作参数需要进行更进一步的表征。FMEA基于以下三个方面进行权衡：操作参数发生漂移的影响严重程度，发生频率以及漂移的可检测性。在工艺开发工作的历史数据的基础上，工艺开发工程师将能够评价操作参数的严重性。操作人员对全规模生产设备操控的熟悉度需要提供发生和检测信息。因此，故障模式与影响分析通常需要各个团体的共同努力，包括工艺开发、工艺过程、生产制造以质量控制。通过风险评估，应该可以基本明确关键工艺参数及其控制和表征范围、关键性能参数。缩小模型开发及证明：在缩小模型开发的过程中，需要说明实验室规模和商业规模的关键性能参数的等价性。理想情况下，商业规模的性能参数应该作为基线指导缩小模型的开发。如果没有全国模的数据，中试规模的性能可以提供初步的放大信息。在以上情况下，工艺表征具有一定的危险性，一旦获得商业规模的数据应对模型进行重新评价。缩小模型开发及证明的典型过程如图2所示，实验室规模生物反应器通常作为生产阶段的主要缩小模型，其它的培养系统如摇瓶和转瓶常被用于种子培养阶段和筛选原料。一个好的缩小模型不仅需要与生产规模的性能相匹配，还要与关键操作参数改变的响应相匹配。因为在正常操作条件下对两种规模进行比较是不切实际的，因此需要采用一个适当的缩小比例以确保不同规模间比例的一致性。然后我们就可以在工艺表征研究中采用缩小模型去测试操作参数变化对工艺性能及产品质量属性的影响。细胞培养操作参数可以分为体积依赖参数(工作体积、补料不体积、搅拌、通气)和非体积依赖型参数(pH、溶氧、温度)。缩小模型开发的大致策略是适当缩小体积依赖型参数，保持与大规模工艺设置点一样的非体积依赖型参数。然而，反应器搅拌速度和通气速率等体积依赖型参数往往比较难进行线性缩小，因为生物反应器的几何形状、液体表面积和体积比、通气状况和控制能力等。因此，在不显著影响最终工艺性能和产品质量的情况下，体积依赖型参数可能会采用不同操作条件。建立了缩小模型后，需要证明缩小模型与大规模工艺的可比性。明确细胞培养工艺的关键性能参数如细胞生长情况、产品质量属性以及可接受范围，并作为缩小模型的资格标准。理想情况下规模比较研究应该在相同的条件下进行平行对比研究，包括原料、培养基、种子等，除体积依赖型参数外的参数都要在各参数的中性附近。单因素范围研究：此步骤的主要目的是鉴别关键操作参数及其可接受范围。范围研究将会在保持其它参数保持不变的同时改变一个操作参数。一个操作参数的不同范围如图三所示。操作范围的中心点(OR)常作为工艺控制设置点除非该参数正在进行参数评估。将会采用操作范围的两倍到三倍范围去测试操作参数对最终工艺性能的影响。参数的可接受范围将会位于表征范围的内部或外部，主要取决于受表征的各种操作条件下的最终的细胞培养性能结果。基于个别参数导致的工艺失败风险通过FMEA分析确定每个潜在关键操作参数的表征范围。对涉及多个参数的工艺的关键参数的筛选可以采用试验设计(DOE)进行。然而，因为细胞培养工艺的潜在关键操作参数的数量相对较少，且操作参数对工艺性能的影响是高度非线性的，单因素范围研究更适合用于筛选关键因素和确定可接受范围。实验设计相互作用研究和最糟糕案例研究：在单因素范围研究确定关键操作参数之后，接着进行参数间的相互作用影响。常常采用统计学设计实验，部分析因设计以两个不同的水平代表每个操作参数的上限和下限。然而，需要注意的是，部分析因设计不能解决所有的相互作用，因为关键参数间的相互作用可能会被非关键相互作用参数所影响。在DOE设计时，必须确保重要相互作用不被非重要相互作用所干扰。相互作用研究的结果将会被用于确认生产工艺的耐用性。DOE实验也能帮助确认最糟糕案例条件，由每个参数的极组合而成，从而在生产时产生最糟糕的性能。关键性能参数常用于鉴别最糟糕案例条件，例如细胞活率、产品滴度、产品质量属性。需要对最糟糕案例条件生产的原料进行进一步纯化，从而评价是否会对下游操作及产品质量造成影响。表征研究可以基于不同的操作单元分解为多个部分。一个典型的细胞培养生产工艺包括种子复苏，种子扩增及生产阶段，通常需要分别进行表征。此外，还应进行培养基保存测试及细胞系稳定研究。细胞培养表征分析组强大的支持才能监控产品的质量。同时也需要下游收获和纯化组的合作。表征研究所使用的一些细胞培养材料可以作为下游操作的进料流，特别是最糟糕案例研究。材料及方法细胞系和培养基：本研究采用的是表达重组糖蛋白的CHO细胞系，培养基为专利无血清培养基及补料溶液，培养方式为悬浮培养；剪切力保护剂的浓度为0.5g/L的PF-68。细胞培养操作：细胞培养工艺为在固定时间点进行补料的补料批式培养，时长为13天。小规模细胞培养实验的反应器为2LApplikon生物反应器，开始培养的体积为1.4L，最终工作体积为2L。大规模细胞培养采用的是2000L的生物反应器，初始体积为1400L，最终的工作体积为2000L。共进行4次2000L培养，为缩小模型开发建立性能基线。分析方法：每天取样在Cedexcellcounter进行计数，记录活细胞密度及活率。葡萄糖、谷氨酰胺、乳酸和氨等细胞培养代谢物采用NOVABioprofile400进行检测，离线pH和溶氧采用血气分析仪进行分析。蛋白产物浓度采用HPLC进行检测。糖型采用等电聚焦电泳进行分析。结果及讨论缩小模型开发及证明：因为溶氧、温度、pH、接种密度、营养物质浓度、搅拌剪切力、气体鼓泡等参数能显著影响细胞声场和蛋白质产量，所以在细胞培养工艺缩小模型中将这些参数作为关键参数。缩小模型开发采用2L的Applikon生物反应器。大规模生物反应器和小规模生物反应器的为体积依赖型参数均设定在相同的设置点。在体积依赖型参数中，生物反应器工作体积和补料体积根据体积的差别进行线性缩小，而叶轮搅拌速度、通气速率需要进行调整，不完全取决于体积比。因为哺乳动物细胞对剪切力较为敏感，高搅拌速度会对细胞产生剪切力伤害，但是低搅拌速度又会引起传质效果不好且有时会引起细胞结团。每体积功率、叶轮尖端速度、能量消耗等准则都已经被作为搅拌速度放大的匹配目标。本文将研究基于等单位体积功率(P/V)和等叶轮尖端速度的放大策略。在2L生物反应器中，对150、250、350、450、550rpm等5个搅拌速度进行筛选，其中基于2000L商业化规模的搅拌速度设置，350rpm和550rpm分别代表了等P/V和叶轮尖端速度。图4显示了不同搅拌速度下的细胞生长特性及细胞活率。在150rpm、250rpm、和350rpm时，2L生物反应器的细胞生长情况和细胞活率与生产规模具有可比性。在450rpm和550rpm时，细胞密度和细胞活率均会降低。搅拌和气泡通气均能对细胞造成剪切力伤害。因为高转速的同时需要降低氧气通气速率以维持相同的氧气置换速率，实验中所观察到的细胞活率降低很可能是由于搅拌引起的剪切力损伤。这一结果表明，在2L生物反应器中，高搅拌速度产生的剪切力不利于细胞的生长。在350rpm时稍高的终细胞密度和2000L规模的细胞生长状况更加吻合，所以选择基于等P/V计算得到的350rpm作为缩小模型的搅拌速度，提供与大规模生物反应器具有可比性的混合和剪切力条件。细胞培养过程中通气的主要目的是为细胞提供氧气并带走培养基中的二氧化碳。主要通过两种不同的模式为生物反应器供氧，一种是表面通气覆盖顶部空间，另一种是通过喷气装置喷射氧气。在培养过程中通过喷气装置改变通气速率，以使溶氧根据细胞生长的需要维持在恒定水平。气泡在小规模生物反应器的停留时间相比于大规模生物反应器更短，因为小规模的生物反应器的页面高度更低。因为两个规模的生物反应器的溶氧水平均控制在相同的设置点，为了达到培养的溶氧要求，小规模生物反应器的空气通气速率将会比大规模生物反应更快，这导致溶解的二氧化碳浓度更低。另外，在小规模生物反应器中有相当一部分的二氧化碳被顶部通气从页面剥离。相比之下，大规模生物反应因为液体的表面体积比更低，顶部通气对二氧化碳的清除效率更低。为了避免2000L生物反应器出现高浓度二氧化碳累积，将会把氧气和空气混合通入以提高整体的喷气速率，从而更高效率的带走二氧化碳。在整个运行过程中会调整混合气体中空气和氧气的比例，通过DO控制改变氧气和空气的喷射速率。使用空气和氧气混合气体去除二氧化碳的方法不在2L生物反应器中使用，因为小规模培养具有很高的二氧化碳清楚效率。缩小模型整个运行过程中的pCO2大约为20mmHg，低于大规模培养。为了了解不同二氧化碳水平的潜在影响，我们进行了pCO2范围研究。通过喷气装置通入不同速率的二氧化碳，结果显示在一定范围内pCO2的差异不会影响最终细胞培养的性能(数据未显示)。因此，不将pCO2作为缩小模型证明的关键性能参数。在表一中总结了不同类型的操作参数及其缩小策略。根据定义的缩小模型条件进行了6批2L规模试验，并与4批2000L规模的实验进行对比。两个规模的细胞生长情况、活率、产品效价和产品的糖型等性能参数具有可比性。葡萄糖、谷氨酰胺、乳酸、氨等代谢属性也很相似，只有pCO2性质有显著差异。乳酸浓度随着细胞的生长而升高，在培养后期又会被细胞消耗。值得注意的是乳酸浓度在消耗阶段的差别较大。由于在大、小规模的实验中均观察到了较大差异，所以这些差异来自于工艺本身的变异性而不是规模不同造成的。缩小模型工艺可比性的统计学分析缩小模型证明的关键性能参数包括细胞密度峰值、完整的活细胞密度(IVC)、产品效价、糖型比例。为了说明实验室规模和生产规模的关键性能参数的等价性，我们采用统计学方法进行分析。传统t检验只用于检验数据集是否有统计学差异，而