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CodeNo.：D6130M-MLVRTasecDNASynthesisKit（20μgRNA用）目录内容页码●制品说明1●制品内容1●保存1●试剂盒原理1●cDNA合成反应时的前期准备3●操作方法3●使用例5Ⅰ.cDNA的克隆5Ⅱ.向λ载体中插入cDNA8●cDNA合成实验例9●注意事项10●制品说明以原核细胞或者真核细胞的mRNA为模板合成cDNA后再进行cDNA的克隆，是分子生物学研究中的一种重要手段。利用这一技术可以进行基因的构造解析和目的蛋白质的表达研究等。一般来说，cDNA的合成以及cDNA文库的利用方法是：在合成与目的mRNA互补的双链cDNA后，将双链cDNA与细菌或病毒来源的载体进行重组，再将重组体导入细菌或真核细胞内进行复制、扩增cDNA，然后再对cDNA进行解析，或者再进一步进行体外转录或体外翻译等。使用本试剂盒无需使用载体/引物系统或利用S1核酸酶等除去发卡环结构，只需使用少量的RNA，便能简便高效地制作成高比例的含有5’末端序列的全长cDNA的基因文库。●制品内容（20μgRNA用）1.ReverseTranscriptase（M-MLV）（200U/μl）10μl2.RNaseInhibitor（20U/μl）10μl3.Oligo(dT)18Primer（1μg/μl）20μl4.RandomPrimer（9mer）（0.3μg/μl）20μl5.5×1stStrandSynthesisBuffer40μl6.dNTPMixture（10mMeach）40μl7.E.coliRNaseH/E.coliDNALigaseMixture20μl8.E.coliDNAPolymeraseI（20U/μl）20μl9.5×2ndStrandSynthesisBuffer300μl10.T4DNAPolymerase（1U/μl）40μl11.RNase-freeH2O600μl×212.ControlRNA（1μg/μl）*5μl*【ControlRNA】本试剂盒中的ControlRNA是以pSPTet3质粒（质粒中的SP6启动子下游插入长约1.4kbp的pBR322来源的DNA片段，其DNA片段上含有抗四环素基因）为模板由SP6RNA聚合酶经体外转录而得到的。ControlRNA（约1.4kbp）是带有30个A碱基的具有Poly(A)+尾的RNA。以这种RNA为模板合成的双链cDNA插入到适当的质粒载体中，如果确实为全长的cDNA，那这种质粒便可获得四环素抗性。●保存：-20℃●试剂盒原理TaKaRa的cDNASynthesisKit主要是以Gubler-Hoffman法为基础构建的，其原理见图1、图2，简要说明如下：1.在逆转录酶的作用下，利用Oligo(dT)18Primer或者RandomPrimer合成cDNA的第一条链。2.使用E.coliRNaseH使DNA-RNA杂合体中的RNA链形成单链切口（Nick）。3.在E.coliDNAPolymeraseI与E.coliDNALigase的作用下，RNA链被DNA链置换，合成cDNA的第二条链。4.使用T4DNAPolymerase使双链cDNA片段末端平滑。-1-图1.使用OligodTPrimer时的cDNA合成原理图2.使用RandomPrimer时的cDNA合成原理-2-●cDNA合成反应时的前期准备A）实验器材及实验试剂1.实验器材市售的一次性灭菌塑料器材通常被认为是无RNase的，可以直接使用。微量离心管以及吸液枪头等需要经过高温高压灭菌后方能使用。可以干热灭菌的器材（如玻璃器具等）必须在160℃干热灭菌2小时以上；不能干热灭菌的器材（如塑料制品）须用0.1%的DEPC溶液在37℃下处理12小时以上后，经高温高压灭菌后使用。做RNA实验的器材必须和一般实验器材严格分开。此外，做RNA实验时，通过人手混入RNase的机率极大，因此，进行实验操作时，一定要戴一次性橡胶手套。2.溶液试剂用于cDNA合成反应的溶液试剂尽可能用0.1%DEPC进行处理，并在高压灭菌后使用。有些试剂不能高压灭菌时，首先用经过灭菌的器具、水等配制溶液后，再将溶液进行过滤除菌处理。使用的溶液试剂和蒸馏水都要求RNA实验专用。B）mRNA的精制和分析1.总RNA的制备除了利用CsCl密度梯度离心法或者硫氰酸胍苯酚氯仿法（AGPC法）等一般方法之外，也可利用本公司的Catrimox-14RNAIsolationKit（TaKaRaCode：DWA005）来制备总RNA。2.Poly(A)+RNA的分离通常采用Oligo（dT）纤维素或Poly（U）Sepharose的亲和层析法将Poly(A)+RNA从总RNA中分离出来。3.Poly(A)+RNA的分析为了得到最大程度的cDNA合成活性，获得纯度高且完整的Poly(A)+RNA是极为关键的。建议使用乙二醛/DMSO或甲醛变性琼脂糖凝胶电泳的方法对制备的Poly(A)+RNA进行分析，检查其完整性。●操作方法1ststrandcDNA合成反应1.在微量离心管中配制下述反应液，全量20μl。TemplateRNA（poly(A)+RNA）2μg5×1stStrandSynthesisBuffer4μldNTPMixture1μlRNaseInhibitor1μlOligo(dT)18或RandomPrimer2μlReverseTranscriptase（M-MLV）（200U/μl）1μlRNase-freeH2Oupto20μl2.轻柔搅拌混匀。-3-3.室温放置10分钟后，移至42℃恒温水浴槽内。4.42℃反应1小时。5.反应结束后置于冰中冷却2分钟。注）当使用二级结构较为复杂的模板RNA时，在进行cDNA合成反应之前，将RNA溶液于65℃加热5分钟后迅速置于冰中，利用这种办法可以减弱二级结构的影响，提高逆转录反应效率。2ndstrandcDNA合成反应以及末端平滑化1.在第一条cDNA链合成后的微量离心管中按下列顺序配制合成cDNA第二条链的反应液，全量为146μl。合成cDNA第一条链的反应液20μl5×2ndStrandSynthesisBuffer30μldNTPMixture3μlRNase-freeH2O89μlE.coliDNAPolymeraseI2μlE.coliRNaseH/E.coliDNALigaseMixture2μl2.16℃反应2小时。3.70℃加热10分钟。4.加入4μl的T4DNAPolymerase，轻轻搅拌。5.37℃反应10分钟。6.加入15μl的0.25MEDTA（pH8.0）以及15μl的10%SDS溶液，停止反应。合成的cDNA精制1.反应停止后反应液总体积为180μl，加入等量（180μl）的苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）溶液。2.剧烈振荡混匀。3.在室温下12,000rpm离心5分钟，液体分为二层。小心取出水相（上层）移至另一个新的微量离心管中（注意切勿取出中间层）。4.向水相中加入等量（180μl）的氯仿/异戊醇（24:1）溶液，剧烈振荡混匀。5.在室温下12,000rpm离心5分钟，液体分为二层。小心取出水相（上层）移至另一个新的微量离心管中。6.加入150μl的4MCH3COONH4。7.加入2.5倍量的乙醇（825μl），充分混匀。8.室温下放置10分钟。9.在4℃下15,000rpm离心15分钟，除去上清。10.用70%乙醇清洗沉淀。11.用适量的TEBuffer溶解。12.-20℃保存。-4-注）①利用这种方法可以极为有效地除去未反应的dNTP。此外，用Spincolumn层析法或凝胶过滤的方法也可以除去dNTP。②如果采用琼脂糖凝胶电泳胶回收法，不仅可以除去未反应的dNTP，还可以根据分子量来选择回收目的大小的cDNA。③以上操作是模板RNA为2μg）*50250075时的反应系统。实际操作时可以根据模板RNA的使用量来调整1stStrand，2ndStrand的cDNA合成反应液量，具体情况如下表。合成cDNA第一条链合成cDNA第二条链反应液量（含酶）反应液量（含酶2μg20μl1μl3μg30μl2μl4μg40μl3μl5μg50μl3μl模板RNA量*此反应液量中包含用于末端平滑的T4DNAPolymerase。●使用例Ⅰ.cDNA的克隆A）使用甲基化系统（MethylationSystem）进行cDNA克隆如果在想要克隆的cDNA片段中含有Linker所带有的限制酶切位点时，应先用相应的甲基化酶对酶切位点进行甲基化保护，避免cDNA片段在Linker连接→酶切反应时被限制酶切断，以保证插入到载体中的cDNA的完整性。这里介绍的是使用EcoRI的甲基化系统进行cDNA的克隆例。cDNA链的甲基化反应1.在微量离心管中制备下列反应液（浓度表示值为终浓度）。Tris-HCl（pH8.0）100mMEDTA10mM DTT2mMS-Adenosylmethionine（SAM，腺苷甲硫氨酸）80μM双链cDNA0.5~1μgMethylaseEcoRI20UTotal20μl2.37℃反应1小时。3.用等量（20μl）的苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）抽提二次。4.加入1/10量（2μl）的3MCH3COONa溶液。5.加入2倍量（44μl）的无水乙醇。6.-20℃放置30分钟。7.12,000rpm离心20分钟。8.用80%乙醇清洗沉淀后真空干燥。9.用适量的TEBuffer溶解cDNA。10.-20℃保存。-5-Linker连接以及限制酶反应1.在微量离心管中制备下列反应液（浓度表示值为终浓度）。甲基化的cDNA0.01~0.1pmolpEcoRILinkercDNA（摩尔数比）的100倍量以上Tris-HCl（pH7.6）66mMMgCl26.6mMDTT10mMATP0.1mMT4DNALigase350UTotal10μl注）连接反应也可以使用TaKaRaDNALigationKitVer.2(TaKaRaCode.D6022)。2.16℃反应2小时～过夜。3.65℃保温10分钟。4.制备下列反应液，进行EcoRI酶切反应。操作3.的cDNA溶液10μl10×HBuffer（EcoRI用）5μlEcoRI（20~100U）＜5μlH2Oupto50μl5.37℃反应2小时。6.用等量（50μl）的苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）抽提2次。7.加入1/10量（5μl）的3MCH3COONa。8.加入2倍量（110μl）的无水乙醇。9.-20℃冷却30分钟。10.12,000rpm离心20分钟。11.用80%乙醇清洗沉淀后真空干燥。12.用适量的TEBuffer溶解cDNA沉淀。13.用凝胶过滤、Spincolumn层析或凝胶电泳等方法除去未反应的Linker。14.回收cDNA片段。15.插入至适当的载体中。-6-B）使用Adaptor进行cDNA克隆Adaptor与cDNA进行连接反应后，不需要进行甲基化反应和限制酶切反应，便可以直接向载体中插入cDNA片段。这里介绍的是使用EcoRI-NotI-BamHIAdaptor进行cDNA的克隆例。Adaptor的连接反应1.在微量离心管中制备下列反应液（浓度表示值为终浓度）。双链cDNA0.01~0.1pmolEcoRI-NotI-BamHIAdaptorcDNA（摩尔数比）100倍量以上Tris-HCl（pH7.6）66mMMgCl26.6mMDTT10mMATP0.1mMT4DNALigase350UTotal10μl注）连接反应也可以使用TaKaRaDNALigationKitVer.2(TaKaRaCode.D6022)。2.16℃反应2小时～过夜。3.加入1μl的0.5MEDTA停止反应。4.用等量（11μl）的苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）抽提2次。5.加入1/10量（1.1μl）的3MCH3COONa。6.加入2倍量（24.2μl）的无水乙醇