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翟中和王喜忠丁明孝主编细胞生物学（第4版）Copyright©高等教育出版社2011第3章细胞生物学研究方法本章主要内容•细胞形态结构的观察方法•细胞及其组分的分析方法•细胞培养与细胞工程•细胞及其生物大分子的动态变化•模式生物与功能基因组的研究•病毒20-200nm•支原体0.1-0.3µm•细菌0.5-5.0µm•动植物细胞20-30µm•活细胞多是无色透明的直径第一节细胞形态结构的观察方法•肉眼0.2mm•光学显微镜0.2µm•电子显微镜0.2nm•扫描隧道显微镜•样品制备技术分辨率人眼的分辨率0.2mm，光学显微镜的分辨率0.2μm，而电子显微镜可达0.2nm。显微镜观察范围肉眼观察范围一、光学显微镜(lightmicroscope)•从细胞的发现、细胞学说的建立，直至今天光学显微镜仍然是细胞生物学研究的重要工具1.目镜2.准焦螺旋3.物镜4.载物台5.反光镜（一）普通复式光学显微镜——组成•由3部分组成：–光学放大系统（目镜与物镜）–照明系统（光源和聚光镜）–镜架及调节系统光学显微镜光学放大系统目镜物镜照明系统聚光镜光源机械支持系统（一）普通复式光学显微镜——成像•放大的倒立虚像–经物镜形成倒立实像–经目镜进一步放大成虚像（一）普通复式光学显微镜——分辨率•对任何显微镜来说，重要的性能参数是分辨率，而不是放大倍数。•分辨率是指能区分开两个质点间的最小距离•普通光学显微镜最大分辨率0.2µmλ:光源波长N:介质折射率,空气为1,油为1.4α:物镜镜口角(样品对物镜镜口的张角,最大140o,Sinα/2最大0.94)（一）普通复式光学显微镜甲醛石蜡5μm（一）普通复式光学显微镜——样品制备发明：1934~1935荷兰物理学家Zernike设计和发明相差显微镜，并获得诺贝尔奖。优点：样品不需染色，可以观察活细胞。原理：利用光线干涉的原理把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，表现为明与暗的对比，从而提高了各种结构之间的对比度，使标本的各种结构变得更清晰。（二）相差显微镜和微分干涉显微镜相差显微镜（二）相差显微镜和微分干涉显微镜•利用光线干涉的原理，将相位差转换成振幅差，实现对非染色活细胞的观察–A.当两束光的相位相同时，相互干涉的结果使光波的振幅增加，亮度增强。–B.当两束光的相位相反时，则导致光波的振幅降低（二）相差显微镜和微分干涉显微镜•相差显微镜是在普通光学显微镜的基础上，添加“环状光阑”和“相差板”，将光程差或相位差，转换成振幅差。•这是在构造上，相差显微镜不同于普通光学显微镜两个特殊之处。体外培养MDCK细胞在普通（明视场）光学显微镜（A）和相差显微镜（B）下拍摄图像效果的比较微分干涉相差显微镜（DIC）•1952年Nomarski发明，利用两组平面偏振光的干涉，加强影像的明暗效果，能显示结构的三维立体投影。标本可略厚一点，折射率差别更大，故影像的立体感更强。•偏振光经合成后，使样品中厚度上的微小区别转化成明暗区别，增加了样品反差且具有立体感。适于研究活细胞中较大的细胞器。（二）相差显微镜和微分干涉显微镜1、分辨率比普通光镜提高了一个数量级2、录像增差显微镜可以用来直接观察颗粒物质沿着微管运输的动态过程特点：Fourtypesoflightmicroscopy(A)Theimageofafibroblastincultureobtainedbythesimpletransmissionoflightthroughthecell,atechniqueknownasbright-fieldmicroscopy（光学显微镜）(B)phase-contrastmicroscopy(相差显微镜)(C)differential-interference-contrastmicroscopy(微分干涉相差显微镜)(D)dark-fieldmicroscopy(暗视野显微镜)正置显微镜与倒置显微镜比较组成一样，倒置显微镜的物镜与照明系统颠倒，前者在载物台之下，后者在载物台之上，用于观察培养的活细胞，具有相差物镜。（三）荧光显微镜—实物（三）荧光显微镜——基本原理•荧光：分子吸收入射光能量后电子从基态跃迁到激发态，再从激发态回到基态而发出的可见光(波长比入射光长)特点：1.利用汞灯或氙灯作为荧光激发光源，波长较短，分辨率高于普通显微镜；2.核心部件是滤光片系统及专用物镜镜头；3.滤光片系统由激发滤光片和阻断滤光片组成。应用：对细胞内生物大分子进行定性、定位研究。反射波长低于510nm的光520~560nm的绿色荧光透过450~490nm蓝光透过透过波长超过510nm的光物镜样品目镜激发滤光片阻断滤光片（三）荧光显微镜——基本原理（三）荧光显微镜——样品制备•免疫荧光技术•荧光素直接标记技术•绿色荧光蛋白(GFP)的基因与编码某种蛋白质的基因相融合表达•两种以上荧光素标记同一样品，可同时显示不同成分在细胞中的定位（三）荧光显微镜——应用•在光镜水平上，对细胞内特异的蛋白质、核酸、糖类、脂质以及某些离子等组分进行定性定位研究的有力工具荧光显微镜显示出在有丝分裂中期细胞中，纺锤体微管（绿色）、中期染色体（蓝色）和原纤维状蛋白（fibrillarin）（红色）等结构成分（四）激光扫描共焦显微镜（四）激光扫描共焦显微镜•以激光为光源•聚光镜和物镜同时聚焦到同一点上，排除焦平面以外的成像•利用激光扫描装置和计算机高速采集与处理汇聚每一个点上的信息，形成清晰的二维图像•分辨率比普通荧光显微镜1.4～1.7倍（四）激光扫描共焦显微镜•可通过“光学切片”叠加后重构出样品的三维结构zxy3DImageReconstruction荧光显微镜（a）和激光扫描共焦显微镜（b）蓝色为细胞核，绿色为微管二、电子显微镜透射电子显微镜transmissionelectronmicroscope,TEM二、电子显微镜（一）透射电子显微镜—特点•电子束作为光源•电磁透镜聚焦•镜筒高度真空•图像通过荧光屏或感光胶片记录显微镜分辨本领光源透镜真空成像原理光学显微镜电子显微镜200nm近0.1nm可见光（波长约400~700nm）电子束（0.01~0.9nm）玻璃透镜电磁透镜不要求真空要求真空1.33x10-5~1.33x10-3Pa利用样品对光的吸收形成明暗反差和颜色变化利用样品对电子的散射和透射形成明暗反差**电子显微镜与光学显微镜的基本区别电子束的波长与加速电压有关。当加速电压为50～100千伏时，电子束波长约为0.0053～0.0037纳米1．电子显微镜与光学显微镜的基本区别2．电子显微镜的分辨本领与有效放大倍数•电子显微镜分辨率可达0.2nm•电镜的分辨本领是指电镜处于最佳状态下的分辨率3．电子显微镜的基本构造•电子束照明系统•成像系统•真空系统•记录系统（二）透射电镜制样技术——超薄切片技术戊二醛和四氧化锇环氧树脂厚度40-50nm重金属盐超薄切片黑白图像超薄切片机超薄切片技术显示的细胞超微结构•应用超薄切片技术，几乎可以观察细胞的各种超微结构Figure9-45MolecularBiologyoftheCell(©GarlandScience2008)用重金属盐对铺展在载网上的样品进行染色；吸去染料，样品干燥后，凹陷处铺了一薄层重金属盐，而样品凸出的地方则没有染料沉积，结果在图像中背景是黑暗的，而样品像“透明”地光亮。**负染色是只染背景而不染样品，与光学显微镜样品的染色正好相反。（二）透射电镜制样技术——负染色技术（二）透射电镜制样技术——负染色技术•观察线粒体基粒、核糖体、蛋白颗粒及细胞骨架纤维甚至病毒等•重金属盐沉积在铜网上，而样品未被染色（故名负染）•分辨率可达1.5nm左右（二）透射电镜制样技术——冷冻蚀刻技术•包括冰冻断裂与蚀刻复型两步•观察膜断裂面上的蛋白质颗粒和膜表面形貌特征，图像有立体感•样品不需固定包埋冰冻蚀刻电镜照片—细胞断裂面结构透射电镜照片与冰冻断裂和冰冻蚀刻电镜照片比较（三）扫描电镜技术•利用电子“探针”在样品表面进行“扫描”激发样品表面放出的二次电子成像，可以得到样品表面的立体形貌（三）扫描电镜技术•样品利用CO2临界点干燥法处理•样品观察前喷镀一层金膜•一般扫描电镜的分辨本领仅为3nmFigure9-49(part1of2)MolecularBiologyoftheCell(©GarlandScience2008)RedbloodcellYeastSperm小结：光镜、透射电镜与扫描电镜原理比较注意样品制备技术的差异！第二节细胞及其组分的分析方法一、用超离心技术分离细胞组分•差速离心：利用不同的离心速度所产生的不同离心力，将各种质量和密度不同的亚细胞组分和各种颗粒分开差速离心一、用超离心技术分离细胞组分•密度梯度离心：通过离心力的作用使样品中不同组分以不同的沉降率在密度梯度溶液中沉降，形成不同的沉降带1.速度沉降velocitysedimentation•用途：分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。•特点：介质密度较低。•原理：介质密度梯度平缓，分离物按各自的沉降系数以不同的速度沉降而达到分离。2.等密度沉降isopycnicsedimentation•用途：分离密度不等的颗粒。•特点：介质密度高，陡度大，介质最高密度大于被分离组分的最大密度。力场比速率沉降法大10~100倍，需要高速或超速离心。•原理：样品各成分在连续梯度的介质中经过一定时间的离心则沉降到与自身密度相等的介质处，并停留在那里达到平衡，从而将不同密度的成分分离。用超速离心技术分离细胞组分组织匀浆分离出各组分差速离心密度梯度离心差速离心：分离密度不同的细胞组分密度梯度离心：精细组分或生物大分子的分离用途：于分离细胞器与生物大分子及其复合物二、细胞成分的细胞化学显示方法•显色剂与细胞组分中特殊基团的结合•通过显色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来判断蛋白质、核酸、多糖和脂质在细胞中的分布和相对含量福尔根反应Feulgenstain•特异显示细胞内呈紫红色的DNA的分布•原理：酸水解可以去除RNA，仅保留DNA，并除去DNA上嘌呤脱氧核糖核苷键的嘌呤，使脱氧核糖的醛基暴露。所暴露的自由醛基与希夫试剂（Schiff’sreagent）反应呈紫红色。DNAFeulgen反应多糖PAS反应如淀粉、纤维素及动物细胞中的糖原、粘蛋白等。脂类苏丹染色等蛋白质Millon反应三、特异蛋白抗原的定位与定性•细胞内特异蛋白的显示可通过抗原－抗体特异结合的方法得以实现•若抗体偶联荧光染料，则可以通过荧光显微镜、激光共焦显微镜观察•为了观察特异蛋白在细胞内的精细定位，抗体需偶联电子致密物(胶体金)，用电镜观察抗原：能刺激机体产生抗体的物质。抗体：由抗原刺激在机体内产生，并与抗原发生特异性结合的蛋白质的总称。多克隆抗体：由不同的B淋巴细胞产生的抗体混合物。（一）免疫荧光技术免疫荧光技术：将免疫学方法（抗原抗体特异结合）与荧光标记技术结合起来，研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。利用荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下检出，从而可对抗原进行细胞定位。（一）免疫荧光技术（一）免疫荧光技术•直接间接免疫荧光技术（A）•间接免疫荧光技术（B）免疫荧光染色观察肿瘤细胞骨架将抗体进行特殊标记后用电子显微镜观察免疫反应的结果。免疫胶体金技术：将抗体与金颗粒偶联，经免疫染色后，在电镜下金颗粒所在部位即为抗原位置。（二）免疫电镜技术（二）免疫电镜技术•在超微结构水平上研究特异蛋白抗原的定位•免疫胶体金技术受到越来越多的青睐四、细胞内特异核酸的定位与定性•原位杂交：用标记的核酸探针通过分子杂交确定特异核苷酸序列在染色体上或在细胞中的位置原位杂交技术•光镜水平–同位素标记或荧光素标记的探针•电镜水平–生物素标记的探针与抗生物素抗体相连胶体金标记结合人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交照片五、定量细胞化学分析与细胞分选技术主要应用：★用于定量测定细胞中的DNA、RNA或某一特异蛋白的含量；★测定细胞群体中不同时相细胞的数量；★从细胞群体中分离某些特异染色的细胞；★分离DNA含量不同的中期染色体。流