流式细胞仪

1流式细胞仪（FlowCytometer)流式细胞仪是一种新型高科技仪器，涉及的技术有：激光技术、流体力学技术、电子物理技术、光电测量技术、计算机技术以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术等。应用流式细胞仪对于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行快速的、多参数的定量分析和分选的技术称为流式细胞术（FlowCytometry,FCM）。可检测生物颗粒的理化性质包括细胞大小、形态、胞浆颗粒化程度、DNA含量、总蛋白质含量、细胞膜完整性和酶活性等。在细胞生物学、免疫学、肿瘤学、血液学、病理学、遗传学、临床检验等学科广泛应用。第一节基本原理V60至70年代是其飞速发展时期，激光技术、喷射技术以及计算机的应用使流式细胞仪在原理和结构上形成了固定的模式。发展历史V80年代则是流式细胞仪的商品化时期，这期间不断有新型号的仪器推出，在多参数检测技术上不断提高。TypicalResearchCytometer(Coulter753)(1980s)LasersFluidicsComputersDetectorsLaserPowerSupply$200-300,000V进入90年代，随着微电子技术特别是计算机技术的发展，流式细胞仪的功能也越来越强大。在数据管理、数据分析方面有了长足进步。但是，在技术原理和设计方面并没有突破性的进展。人们的注意力开始转向流式细胞仪的应用，新的荧光探针、新的荧光染料、新的染色方法不断推出，使流式细胞技术在新的细胞参数分析方面日益发展V进入21世纪后，各种不同规格的流式细胞仪产品多种多样，小型化、多功能、高效率成为发展趋势。Publicationsusingthekeyword“flowcytometry”from020004000600080001000012000•1975-1976•1976-1977•1977-1978•1978-1979•1979-1980•1980-1981•1981-1982•1982-1983•1983-1984•1984-1985•1985-1986•1986-1987•1987-1988•1988-1989•1989-1990•1990-1991•1991-1992•1992-1993•1993-1994•1994-1995•1995-1996•1996-1997•1997-1998•1998-1999•1999-2000•2000-2001•2001-2002020004000600080001000012000•1975-1976•1976-1977•1977-1978•1978-1979•1979-1980•1980-1981•1981-1982•1982-1983•1983-1984•1984-1985•1985-1986•1986-1987•1987-1988•1988-1989•1989-1990•1990-1991•1991-1992•1992-1993•1993-1994•1994-1995•1995-1996•1996-1997•1997-1998•1998-1999•1999-2000•2000-2001•2001-2002Thegrowthofdiagnosticandphenotypicdeterminationtechnologies62,496references(2002)1st生物学颗粒分析原理z将悬浮分散的单细胞悬液，经特异荧光染料染色后，放入样品管。z在气体压力的作用下，悬浮在样品管中的单细胞悬液形成样品垂直进入流式细胞仪的流动室，沿流动室的轴心向下流动，流动室轴心至外壁的鞘液也向下流动，形成包绕细胞悬液的鞘液流。z鞘液流和样品流在喷嘴附近组成一个圆柱流束，自喷嘴的圆形孔喷出，与水平方向的激光束垂直相交，相交点称为测量区。z染色的细胞受激光照射后发出荧光，同时产生光散射。2z荧光和光散射信号分别被呈90°角方向放置的PMT荧光检测器和前向角放置的光电二极管散射光检测器接收。z经过转换器转换为电子信号后，由模/数转换输入计算机。z计算机通过相应的软件储存、计算、分析，可以得到细胞的大小、活性、核酸含量、酶和抗原的性质等物理和生化指标。细胞分选原理z在压电晶体上加上频率为30kHz的信号，使之产生同频率的机械振动，流动室也随之振动，使通过测量区的液柱断裂成一连串均匀的液滴。z各类细胞的特性信息在细胞形成液滴前在测量区已被测定，并被储存在计算机中。z单某类细胞的特性与要分选的细胞相同时，流式细胞仪就会在这类细胞形成液滴时给液滴充以特定电荷，而不符合分选条件的含细胞液滴及不含细胞的空白液滴则不被充电，即不带电荷。z带有电荷的液滴向下落入偏转板间的静电场时，根据所带电荷的符号分别向左或右偏转，落入指定的收集器内；不带电荷的液滴落入废液槽中。流式细胞仪的基本结构z流动室及液流驱动系统z激光光源及光束形成系统z光学系统z信号检测与存贮、显示、分析系统z细胞分析系统z流动室及液流驱动系统流动室（FlowChamber或FlowCell）是FCM的核心部件，被测样品在此与激光束相交。细胞流和鞘液流的驱动一般采用加正压的方法，流速与压力的关系服从贝努里（Bernouli）方程，即：221pvP=只要压力恒定，即可得到恒定的鞘液流流速，从而确保每个细胞流经激光照射区的速度不变。调节采样分析速度控制鞘液流速3由于激光焦点处能量分布为正态分布，中心处能量最高。当检测分辨率要求较高时，一般应选择低速。z激光光源及光束形成系统台式机一般采用氩离子气体激光器，有些仪器可增配小功率半导体激光器（635nm），拓宽其染料的应用范围。氩离子激光器主要输出波长有：514.5nm，488nm，496.5nm，476.5nm，452.9nmPrimarylaser：excitationat488nmSecondlaser：excitationat351-364nmThirdlaser：excitationat568-647nmz光学系统FCM光学系统是由若干透镜组、滤光片和小孔组成，它们分别将不同波长的荧光信号送入不同的电子探测器。488nmlaser+-ChargedPlatesSinglecellssortedintotesttubesFALSSensorFluorescencedetectorz信号检测与存贮、显示、分析系统当细胞携带荧光素标记物通过激光照射区时，细胞内不同物质产生不同波长的荧光信号。这些信号以细胞为中心，向空间360°立体角发射，产生散射和荧光信号。散射光信号不依赖任何细胞样品的制备技术前向角散射（FSC)与被测细胞的大小有关：与细胞直径的平方密切相关。选取FSC做阈值来排除样品中的各种碎片及鞘液中的小颗粒，以避免对被测细胞的干扰。z信号检测与存贮、显示、分析系统当细胞携带荧光素标记物通过激光照射区时，细胞内不同物质产生不同波长的荧光信号。这些信号以细胞为中心，向空间360°立体角发射，产生散射和荧光信号。散射光信号不依赖任何细胞样品的制备技术侧向角散射(SSC)与激光束正交90°方向的散射光信号对细胞膜、细胞质、核膜的折射率敏感，可提供细胞内精细结构和颗粒性质的信息z信号检测与存贮、显示、分析系统荧光信号依赖细胞样品的制备技术细胞自身发出的微弱荧光信号细胞自发荧光：细胞标记荧光：经过特异荧光标记物标记，受激发照射得到的荧光信号，对其进行检测和定量分析可对样品细胞进行定性、定量分析。4ProbesforProteinsFITC488525PE488575APC630650PerCP™488680CascadeBlue360450Coumerin-phalloidin350450TexasRed™610630Tetramethylrhodamine-amines550575CY3(indotrimethinecyanines)540575CY5(indopentamethinecyanines)640670ProbeExcitationEmission•Hoechst33342(ATrich)(uv)346460•DAPI(uv)359461•POPO-1434456•YOYO-1491509•AcridineOrange(RNA)460650•AcridineOrange(DNA)502536•ThiazoleOrange(vis)509525•TOTO-1514533•EthidiumBromide526604•PI(uv/vis)536620•7-AminoactinomycinD(7AAD)555655ProbesforNucleicAcids荧光信号线性测量和对数测量：主要由电子线路完成荧光信号滤色片PMT放大器线性放大器对数放大器细胞DNA含量、RNA含量、总蛋白质含量测定细胞膜表面抗原的分布，阳性群、阴性群同时显示荧光信号的面积：采用对荧光光通量进行积分测量，主要用于对DNA倍体测量。z荧光脉冲的面积比荧光脉冲的高度更能准确反映DNA的含量。z当形状差异较大，而DNA含量相等的两个细胞得到的荧光脉冲高度不等时，对荧光信号积分后，所得到的信号值相等。荧光信号的宽度：用于区分双连体细胞。z当两个G1期细胞粘连在一起时，测量到的DNA荧光信号会与G2期细胞相等，造成检测误差。z通过区分荧光信号的宽度可确定荧光信号对应的是单个细胞或多个细胞。光谱重叠的校正：当采用两种以上荧光标记时，会因为发射光谱的重叠造成检测误差。z使用荧光补偿电路，利用已知标准样品或荧光小珠，可合理设置荧光信号的补偿值。z采用双激光立体光路技术，可减少各荧光间的相互补偿。5z细胞分析系统由水滴形成、分选逻辑电路、水滴充电及偏转三部分组成。1.小水滴的形成通过压电晶体的振动使自喷孔喷出的流束形成水滴。喷嘴的振动频率即为每秒钟产生水滴的数目。若喷嘴直径为50μm，信号频率为40kHz，则每秒钟产生4万个水滴。2.逻辑电路为了分选细胞，需要细胞在经过测量区时判断出哪个细胞满足分选条件，并产生一个逻辑信号，此信号驱动充电脉冲发生器，使之产生充电脉冲。给水滴充电的脉冲不是在做出分选决定时立即产生并加到流束上的，而是当细胞到达分离点时才加上的。喷孔的直径、细胞与激光束相交点的位置等因素会影响这个过程的时间。由细胞通过测量区到小水滴分离的时间大约为几十毫秒，称为延迟时间。精确的测定延迟时间是决定分选质量的关键。测定所需平均延迟时间的不准确性、喷射液流的变化、水滴分离点的变化、细胞本身对水滴形成条件的影响等因素会使延迟时间受到一系列影响。zFCM测量数据的存贮、显示与分析FCM数据存贮的方式均采用列表排队（ListMode）方式，可实现多参数指标。有数据显示、一维直方图、二维点图、等高线图、密度图等多种显示方式。通过分析软件可得到多种参数。C-kitReceptorExpressionOnHPCSubsetsCD117HLADrCD117CD117CD117CD386DNAAnalysisFALSFLUORESCENCEFluorescenceForwardScatterForwardScatterSideScatterForwardScatterFluorescencePopulationgatingForwardScatterSideScatterNote:LesscellsFluorescenceofyeaststainedwithFITC第二节流式细胞仪的分类根据功能不同可分为临床型（台式机）和科研型（大型机）。临床型：只有分析能力，没有分选功能，仪器的光路调节系统固定，自动化程度高，操作简便。科研型：既有分析功能又有分选功能，可快速将所感兴趣的细胞分选出来，可选配多种波长和类型的激光器，适用于更广泛更灵活的科研内容。根据结构不同可分为一般流式细胞仪和狭缝扫描流式细胞仪（Slit-scanFlowCytometer)。一般型：激光光斑为椭圆形，光斑直径大于被检测细胞的体积，只能提供细胞内某种生物化学成分的参数，不能对细胞形态以亚细胞形态进行分辨，被称为零分辨率的流式系统。狭缝扫描型