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制片技术是生物科学中必不可少的研究手段，在生物科学的领域中占有重要的地位，现在已经成为生物学工作者必须掌握的一门技术。生物制片技术简单地说就是要利用各种方法将生物体或者组织、器官制成适合于显微镜下观察的薄片，并要显示出清晰的显微结构的一门技术。第五章生物显微制片技术一、生物制片的分类根据所制成片子保存时间的长短分类:◦临时制片◦永久制片根据其制作的方法分类：◦活体观察◦切片法◦非切片法1、活体观察活体观察是将生物体的个体或者其一部分，就其生活状态置于载玻片上加一滴水和盖玻片或放置于培养皿中直接进行镜检，从而达到预定的检查目的优点：简便省时；可观察到活体的情况；不需要什么特殊设备。缺点：未经其它处理，材料或者过厚阻碍光线通过，或者无色透明难以区分，结果不能令人满意。2、切片法切片法是利用锋利的刀具(简单的刀片或复杂的切片机）将材料切成薄片◦徒手切片法(freehandsection)◦滑走切片法(slidingsection)◦火棉胶切片法(celloidinmethod)◦冰冻切片法(freezingmethod)◦石蜡切片法(paraffinmethod)◦超薄切片法(电镜切片法)(electronmicroscopicsectionmethod)◦振动切片法徒手切片法利用刀片或有柄剃刀徒手将材料切成薄片后置于载玻片上进行活体观察，或经过一系列药品处理，制成永久片子。此法常做临时制片，必要时也可作成永久制片。方法简便、快速，要求设备简单。徒手切片技术要求熟练，才能切出符合要求的薄片，切片厚度为20-25um。切取的标本材料和夹持物滴水放置标本加盖盖玻片叶的横切徒手切片法蓖麻茎厚角组织和花青素，未染色徒手切片法示海桐花嫩茎初生结构滑走切片法滑走切片法(slidingsection)：是用滑走切片机进行切片，可以获得一定厚度、完整和均匀的切片，主要用于切一些硬质材料（如木本茎、枝条、骨质等），不需要包埋的过程，但也可以切包埋的材料。切片厚度为1-25um。德国Leica公司SM2000R滑走切片机滑走切片法锦鸡儿的次生木质部，番红染色火棉胶切片法火棉胶切片法是利用火棉胶作包埋剂，使组织材料包埋在火棉胶中，再行切片的方法。火棉胶易溶于酒精和乙醚的等量混合液，其溶液不溶于氯仿（包括含有氯仿的混合液），遇氯仿即变硬，利用这一性质，经固定的材料，脱水后，浸入由等量酒精和乙醚配制的火棉胶溶液中透胶、包埋、再置于氯仿中使其硬化，制成包埋块，便可行切片、染色等步骤。火棉胶切片法与石蜡切片法相比较，能减少组织收缩，但是所需时间较长及制成连续切片手续麻烦。冰冻切片法冰冻切片法是将已固定或新鲜的组织块不经脱水先进行冰冻，然后在切片机上进行切片的一种方法。冰冻切片法具有手续简单、制片速度块并能完整保存细胞结构及生物大分子活性（如脂肪、酶等）的特点，常用于临床上的病理快速诊断及原位杂交或细胞化学的制片。切片厚度为10-50um。德国LeicaCM3050S冰冻切片机石蜡切片法石蜡切片法是动物、植物和病理组织切片制作上最重要、最常用的一种方法。石蜡切片法就是将材料经过各种处理，包埋于石蜡中，然后在切片机上切成薄片，最后制成永久制片一般的材料都可以使用石蜡切片法（除了藻类、菌类、木材外），它既可以制成较薄的切片，使材料各部分清晰可见，同时也可制连续切片，观察材料的动态发生及层次。切片厚度为5-15um。石蜡切片法洋葱根尖细胞有丝分裂，铁矾-苏木精染色石蜡切片法花生老根横切面，番红-固绿双重染色石蜡切片法南瓜茎横切面，番红，固绿和橘红G三重染色小白鼠肝脏细胞石蜡切片法莴苣瘦果石蜡切片横切面3、非切片法所谓非切片法，是指不经过切片手续而作成制片的方法。它与活体观察的区别在于：非切片法常常经过药剂或染色剂的处理，这样组织被杀死后经过染色可作成临时或者永久制片。分类：整体制片法（整体封藏法）：昆虫口器、浮游动物、花粉粒涂片法：血液、粪便伸展法：皮下结缔组织、肠系膜磨片法：牙齿、耳石、贝壳压片法：根尖、果蝇唾液腺离析法（组织分离法）：木材纤维（铬酸－硝酸）、肌纤维（KOH-HNO3）整体封固（装片）法整体封固法就是不必经过切片手续而将整个微小的或透明的生物体或器官封藏起来，制成整体装片的方法。适用于一些小型或者扁平的材料，如单细胞、丝状或叶状的藻类、菌类或蕨类的原叶体、孢子囊、纤细的苔藓植物，种子植物的花粉粒和表皮、幼胚以及其他幼小的器官，原生动物、蠕虫、昆虫的幼胚等不必经过切片手续，就可以显示生物体或生物器官的整体。优点：是能明显地表现出其器官的全部特性；缺点：是由于生物的整体有的是几层细胞，比较厚，不容易看清楚。整体封固法的分类：根据所用的脱水剂、透明剂和封固剂的不同而有多种方法，包括有甘油法、甘油冻胶法、甘油－二甲苯法、松节油法、叔丁醇树胶法、二氧六环树胶法等。整体封固法茄叶表皮毛和花青素，未染色整体封固法马铃薯淀粉粒整体封固法辣椒外果皮细胞和纹孔对，固绿染色米根霉形态整体装片菊花花粉粒的整体装片组织分离法（离析法）组织分离法：是利用一些化学药品或者酶的作用把生物细胞间的胞间层溶解，是生物组织的细胞分离开来，从而得到单个完整细胞，以便在显微镜下观察细胞的立体形态结构。缺点：是由于组织的细胞间彼此分离，细胞间的关系无法显示，也就不可能了解整个组织的结构。离析法杨茎的木纤维和导管分子组织分离法叶片表皮细胞及气孔压片法压片法（压碎法）：是把动、植物的器官或组织经过处理后压在载玻片上，使细胞成一薄层，以便进行观察。压片法为细胞学、遗传学研究较为理想的方法，主要用于染色体的形态观察、染色体计数、细胞分裂观察等。压片法莴苣染色体磨片法一些含有矿物质的比较坚硬的动物组织要作成玻片标本时，常把材料直接放在砂石上磨成薄片，此法即为磨片法。如珊瑚的骨骼、软体动物的贝壳，脊椎动物的硬骨、角以及牙齿等都可以用此法制成玻片标本。三、生物制片的总体原则各种生物制片方法各有优缺点，应用时根据具体情况，决定选择哪一种制片方法，必要时可以相互配合，以发挥制片技术的效果。因此，要根据观察的目的，材料的性质而决定采用何种制片方法。四、生物制片的基本要求要尽量保持材料原来结构的真象；切片要根据观察的目的切成适当的厚度；无论运用何种染色方法，都要使内部结构清晰易见；制成的片子要保持长久、不褪色、不变形。五、生物制片的基本程序及原理以石蜡切片法为例说明基本程序◦选材；◦杀死、固定及保存；◦冲洗与脱水；◦透明与包埋◦切片◦染色；◦透明与封藏1、选材选材的原则：◦选材时，应根据实验的目的、要求，决定选取生物体的哪一部分；◦确定选择哪一部分后，应注意选择有代表性的材料，材料要求新鲜、准确、完整，材料要避免挤压、挫伤、干枯、病、虫等危害、生长不良；◦取材时，在有代表性的基础上，材料宜小不宜大，动物组织的切片，厚度不超过3mm，体积不大于1.5cm×1.5cm×0.5cm，植物组织应根据试剂情况，细的茎和窄的叶片可切取3-5mm长一小段，粗的根、茎或宽的叶片，也可以切取一部分进行固定。所采集材料应立即放入固定剂，并编号，注明采集时间、地点、名称、组织部位，所取组织块要大小适当，即要能说明问题，又要考虑固定剂的穿透能力。一般组织学取材稍大，细胞学取材稍小，植物组织取材稍小，动物组织取材要稍大。2、杀死杀死：指用物理或化学的方法，迅速地终结生物组织的生命，不仅要求生物体立即死亡，而且还要使每个细胞差不多同时停止生命活动。植物体：直接割取所需部分，但需要足够快；动物体：断头法、木棒猛击头部使它昏倒、动物麻醉以后，割取材料；不论是植物还是动物在切取材料之前，应先把材料用水冲洗干净（如观察菌类寄生状况的材料，则不应经水冲刷），然后将材料切成小块。2.1动物的麻醉和杀死从活的动物体上采取材料不象采集植物材料那么容易，因为在不施加麻醉的情况下，有的动物会收缩(如蚯蚓、水蛭)，有的会骚动(如蛙、鼠)，使我们无法下手。但制片所需的材料又要求越新鲜越好，尤其是细胞学方面的研究对材料的新鲜程度要求更严。因此，要割取生活着的动物组织，在一般情况下，就要对动物施行麻醉，然后再割取材料加以固定。但是，所用的麻醉药品，必须以不影响细胞结构为原则。若是一般的组织学制片，要求不太严格的话则可将动物先杀死然后速取其组织进行固定。蛙、蟾蜍、鼠等较小的动物，可用断头法杀死，即用普通剪刀剪断颈部。较大的动物，如大竺鼠、免、猫等可用木槌猛击头后部，使其昏倒，或用50m1的注射器从耳静脉向心脏注入空气，使动物发生急性空气栓塞痉挛而死。上述动物若需麻醉后取材，则可用脱脂棉球蘸氯仿或乙醚、置于动物的鼻尖部，令其吸入麻醉。大动物(狗、猴等)应用氨基甲酸乙酯作静脉注射麻醉．剂量一般为每kg动物体重用1g。麻醉后的动物也需放血后进行取材固定。昆虫等小动物可投入充满氯仿或乙醚蒸气的大口瓶中，令其麻醉。若要杀死，可将其投入含氰化钾的毒瓶中。2.2动物组织块的切割割取动物组织块时，需注意以下几点：◦第一，要考虑所取的材料应包括各脏器的重要结构或全部结构，如消化管就应包括粘膜、粘膜下层、肌层和外膜四层结构。若所取的器官太大，不易全部制片时，则可切取能代表该器官的部分材料，如狗的肾脏，可切取包括皮质、髓质和肾盂的一部分为材料。◦第二，应注意切割方向．如在管状器官(肠等)取材时，一般是取其横切面制片，但要观察小肠的环行皱壁时，就应取其纵切面制片。◦第三，组织块必须切得小而薄。细胞学制片的组织块不能超过2mm，一般组织块的大小以0.5*0.5*0.2cm为宜，柔软组织不易切小,可先取稍大的组织块固定2-3h。等组织稍硬后再切成薄的小块继续固定。3、固定和保存固定：在杀死的基础上，把组织或细胞按生活状态固定下来，使其在制片的任何过程中都不会发生变化。固定是制片极为关键的一个步骤，制片质量的优劣。除与材料的新鲜程度有关外，还取决于最初的固定是否适当和完全。保存：材料经过杀死、固定后，需要把组织或细胞的结构长久保存下来，不至于发生溶解等其他现象。杀死和固定的关系杀死和固定两者之间的关系极为密切，是两个不同的步骤，但又是相互统一、相互作用的过程。常用的杀死剂，一般都兼作固定剂，常用的固定剂，一般都具有杀死的作用。我们常用的固定剂有的兼作保存作用，例如FAA，材料可长期保存于该溶液中几年或更长时间，也不会变坏。有的固定剂如苦味酸类，在固定作用完成之后必须更换保存液，否则材料变坏。通常所用的保存液为70％的乙醇溶液，一般材料在其中可保存较长时间。固定目的迅速地杀死原生质，防止组织自溶和腐败；使细胞内的蛋白质、糖、脂肪等各种成分沉淀保存下来从而保存细胞的各种组成成分使其保持与生活时相近似的形态和结构；因沉淀及凝固的关系，使细胞内不同的成分产生不同的折光率，增加细胞结构及其内含物的折光程度，造成光学上的差别使原来在生活情况下看不清楚的结构变得清晰易见，便于在显微镜下观察；凝固组织中某些部分，使材料适当硬化，便于切片；促进植物组织对一些染色剂的着色力。固定剂可使材料本身起一些物理上或者化学上的变化，这些变化会导致材料对某些染料亲和力的增强和对另一些染料亲和力的减弱，因此在选用固定剂时应事先考虑到以后用何种染料染色，尽量使固定剂和染色剂相互配合，取得良好的染色效果。固定方法取到新鲜的材料，应按材料的种类、大小、性质和制作要求，进行固定。固定有物理方法和化学方法两种。物理方法固定有干燥、高热和低温骡冷等。例如，血液涂片就是干燥固定；细菌涂片可用加热法固定；许多组织化学反应的制片是以低温骡冷固定作冰冻切片的。化学方法固定就是用化学试剂配制成固定液使之固定。固定时间视材料的种类、大小、性质、固定液的种类与性质、渗透力的强弱等而定，可以从1-2h到十几或二十几小时，甚至可以长至几天。固定作用的原理物理作用：即沉淀作用。例如油类和脂肪等遇到饿酸即发生褐色沉淀。但应指出，某种沉淀发生后又能溶于水，这样就不能认为是固定。化学作用：根据作用机理的不同又可