紫外分光光度法检测桔皮中总黄酮含量的方法研究

现代食品科技ModernFoodScienceandTechnology2009,Vol.25,No.2紫外分光光度法检测桔皮中总黄酮含量的方法研究吕凛，陶宁萍（上海海洋大学食品学院，上海200090）摘要：建立了一种桔皮中总黄酮含量测定的简便而准确的方法。选用测定波长310nm，以芦丁(Rutin，95%)为对照品，采用紫外分光光度法进行桔皮总黄酮含量的检测，并与NaNO2-Al(N03)3-NaOH体系分光光度法，波长510nm下测定其吸光度的方法进行了比较。结果表明：芦丁在10~50mg/L的范围内具有良好的线性关系R2=0.9996，平均回收率为99.68%，RSD为1.20%（n=6）。该方法操作简便，结果准确，可用于桔皮中总黄酮含量的检测。关键词：桔皮；总黄酮；含量测定；紫外分光光度法；芦丁中图分类号：TS207.3；文献标识码：A；文章篇号:1673-9078(2009)02-0217-04DeterminationofTotalFlavonoidsContentinCitrusPeelsbyUltravioletSpectrophotometryLVLin,TAONing-ping（CollegeofFoodScienceandTechnology,ShanghaiOceanUniversity,Shanghai200090,China）Abstract:Asimpleandaccuratemethodforthedeterminationofthetotalflavonoidscontentincitruspeelswasdeveloped.AcomparisonwasmadeforthedeterminationofthecontentoftotalflavonoidsinCitruspeelsbyultravioletspectrophotometryat310nmusingrutinasthestandardcompoundandbythespectrophotometryintheNaNO2-Al(N03)3-NaOHsystemat510nm.Resultsshowedthat,withultravioletspectrophotometryat310nm,goodlinearityofRutinconcentrationwasfoundwithintherangeof10~50mg/L(R2=0.9996)withtheaveragerecoveryrateandRSDbeingof99.68%and1.20%(n=6),respectively.Themethodissimpleandaccurate,whichcanbeappliedtodeterminetotalflavonoidsincitruspeels.Keywords:citruspeels;totalflavonoids;determination;rutin柑橘是芸香科柑橘属植物的成熟果实，其干燥果皮是药材陈皮，具有理气健脾、燥湿化痰作用。柑橘在我国有非常丰富的资源，新鲜柑橘皮中含有丰富的黄酮类物质成分，药理学研究表明黄酮成分是极有效的活性成分，具有抗炎[1]、抗氧化[2~3]、抗过敏作用[4]以及降低血液和肝脏中胆固醇的作用[5]。黄酮类化合物的定量方法常用的有HPLC法和分光光度法[6~8]。在实际生产和科研过程中，考虑到方法的简便、快捷及可行性，对总黄酮含量的测定，多采用NaNO2-Al(N03)3-NaOH体系分光光度法，在510nm下测定其吸光度。由于天然植物的组成非常复杂，各种黄酮类物质性质也存在差别，并且由于黄酮类化合物提取液中各种杂质的存在，如含有的脂溶性色素和芳香油，使显色法测定总黄酮时产生浑浊现象，造成很大误差收稿日期：2008-09-15作者简介：吕凛（1982-），男，浙江宁波人，硕士研究生，主要研究方向：天然功能性物质的开发利用。通讯作者：陶宁萍[9]。这就使分光光度法在实际测定过程中产生一些问题，影响结果的准确性。由于大多数黄酮类化合物分子中存在肉桂酰基和苯甲酰基组成的交叉共轭体系，其MeOH谱200nm~400nm的区域内存在两个主要的紫外吸收带[10]。紫外分光光度法依据黄酮自身结构的特点，不使用显色剂，直接在其特征吸收峰处对供试样进行测定。相比较紫外分光光度法而言，510nm可见光显色法需要的试剂种类多，每一种试剂加入后需要一段反应时间，等待时间长，操作步骤烦琐。本文通过用紫外分光光度法测定各种黄酮类化合物提取液中的总黄酮含量，为提取工艺的优化提供实验依据。1材料与仪器自制桔皮，品种为浙江红橘；紫外可见分光光度计UV-1601PC，SHIMADZU，紫外可见分光光度计UV-2000，尤尼科仪器有限公司，电子天平（分度值0.1mg）BT224，上海恒平科学仪器有限公司，电热恒温鼓风干燥箱DHG-9053A型，217现代食品科技ModernFoodScienceandTechnology2009,Vol.25,No.2上海精宏设备有限公司。芦丁对照品（纯度为95%），Sigma-Aldrich公司，无水乙醇，杭州双林化工试剂厂，纯度为分析纯，亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠，国药集团化学试剂有限公司，纯度为分析纯，自制蒸馏水。2实验方法与结果2.1510nm可见光分光光度法黄酮类化合物具有特定的紫外吸收带，其结构中的肉桂酰环产生的I带在300~400nm内，由苯甲酰环产生的Ⅱ带在220~280nm内，不同的黄酮在这两个吸收带的吸收强度不同[11]。若加入铝盐，则Al3+与黄酮化合物形成稳定的配合物，带Ⅱ会明显向长波方向移动(红移)[12]；在NaNO2强碱性溶液中，其在510nm处吸光度值最大，从而为分光光度法测定提供了可靠的依据。2.1.1对照品溶液的制备精密称取120℃干燥至恒重的芦丁对照品（纯度为95%）0.1117g，用无水乙醇定容至100mL，再稀释至5倍备用，浓度为212.2mg/L。2.1.2标准曲线的制作准确吸取芦丁对照品溶液1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL、6.00mL，分别置25mL容量瓶中，加蒸馏水至6mL，分别加5％亚硝酸钠溶液1.00mL，摇匀，放置6min后分别加10％溶液1.00mL，摇匀，放置6min，再分别加4％溶液l0.00mL，再用蒸馏水定容，摇匀，放置l5min后，以空白溶液为参比，在波长510nm处测吸光度A，得回归方程。A=0.0128C(mg/L)-0.0071（R2=0.9995）2.2310nm紫外分光光度法黄酮类化合物结构中的肉桂酰环和苯甲酰环具有特定的紫外吸收带，因此含黄酮类化合物的原料经一定的提取纯化后，可直接于最大吸收波长处测定其吸收度，以芦丁为对照品计算其含量[13]。2.2.1吸收波长的选择用紫外可见光度吸收扫描仪对芦丁对照品溶液和黄酮类化合物提取液进行190~360nm范围的吸光值扫描，发现在I带和Ⅱ带有大量的吸收峰。其中在I带有一个比较明显而且无干扰的独立峰，在芦丁对照品溶液和各种方法提取的黄酮类化合物提取液中都有存在。如图1~4所示。因此，将310nm定为总黄酮含量的吸收波长，并在后文中与510nm的测定方法进行比较。有报道以芦丁为对照品，在359nm波长测定总黄酮含量[14]，但在实验中，并没有发现359nm波长处有比较明显而且无干扰的独立峰。图1芦丁对照品吸收图谱Fig.1Absorptionspectrumofrutinstandardcompounda黄酮类化合物Ab黄酮类化合物图2超临界萃取的黄酮类化合物A和B吸收图谱Fig.2AbsorptionspectrumofflavonoidsAandBbySFEa黄酮类化合物A218现代食品科技ModernFoodScienceandTechnology2009,Vol.25,No.2b黄酮类化合物B图3b超声波提取的黄酮类化合物A和B吸收图谱Fig.3AbsorptionspectrumofflavonoidsAandBbyultrasonicextraction图4乙醇热回流提取的黄酮类化合物吸收图谱Fig.4Absorptionspectrumofflavonoidsbyhotethanolrefluxextraction2.2.2标准曲线的制作对照品溶液的制备的方法同上，浓度为200.8mg/L。准确吸取芦丁对照品溶液0.00、1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL、6.00mL，分别置25mL容量瓶中，各用无水乙醇定容。以空白溶液为参比，在波长310nm处测吸光度A，得回归方程。A=0.013C(mg/L)+0.0067（R2=0.9996）2.3510nm和310nm分光光度法的比较由于桔皮中含有的脂溶性色素和芳香油，在进行黄酮类化合物的提取过程中，这些物质也会少量的溶出，使510nm显色法测定总黄酮时产生浑浊现象，造成一定误差；而用石油醚萃取脱脂会使部分脂溶性黄酮类化合物同时被萃取出，不仅使得率降低，而且使操作步骤更加繁琐。而310nm紫外分光光度法用无水乙醇直接稀释后测量，不仅操作步骤简单，而且准确。2.3.1标准曲线的比较将两组不同波段下的标准曲线进行比较，从图5中可以看出，芦丁浓度在10~50mg/L范围内线性良好。且在此范围内两标准曲线基本上重合。图5310nm和510nm分光光度法标准曲线的比较Fig.5Calibrationcurvesofflavonoidsconcentrationbyspectrophotometryat310nmand510nm2.3.2对照品溶液和黄酮类化合物提取液的测量将芦丁对照品溶液稀释为200mg/L左右，取4.00mL用无水乙醇定容至25mL，分别在310nm处和510nm处测得总黄酮含量。表1对照品溶液310nm和510nm检测总黄酮含量的比较Table1Favonoidscontentinstandardcompounddeterminedat310nmand510nm组别310nm处测得的总黄酮含量/(mg/L)510nm处测得的总黄酮含量/(mg/L)显著性差异P137.18±0.0835.82±1.261.36E-01236.92±0.1235.61±0.865.95E-02336.82±0.0934.93±1.468.89E-02从表1可以看出，310nm测得的总黄酮含量比510nm的略高，但是两者的差异不显著（P0.05）。而且从数值上看，310nm测得的数值比510nm测得的数值要稳定。对同一黄酮类化合物提取液平行测量5次，值为41.11±0.28mg/L，RSD=0.69%（n=5）。2.3.3加样回收率测定表2芦丁对照品加样回收率Table2RecoveryrateofRutinstandardcontent序号芦丁标准液加入量/mL黄酮类总量/mg测得黄酮类总量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%110.60290.596798.9799.681.20220.70330.7160101.80330.80370.796799.13440.90420.9083100.45551.00460.992998.84661.10501.092998.90把芦丁标准液（浓度为100.4mg/L）加入黄酮提219现代食品科技ModernFoodScienceandTechnology2009,Vol.25,No.2220取液(浓度为502.5mg/L)中做回收率实验，芦丁对照品分别加入1.00~6.00mL，分别与1.00mL黄酮提取液相混合，分别用无水乙醇定容至25mL。由表2可见，回收率范围符合定量分析要求。3讨论由于黄酮类成分均有2-苯基色原酮为母核的结构，而芦丁也有此结构，因此以芦丁为对照检测柑橘黄酮中总黄酮的含量是有科学依据的。黄酮类化合物含量测定方法有HPLC法、紫外分光光度法等。很多文献报道总黄酮的含量测定均以芦丁为