碱性磷酸酶Km值得测定与分子筛层析

碱性磷酸酶Km值得测定【实验目的】1.了解磷酸酶Km值的测定原理和方法；2.掌握磷酸酶活性测定的原理和方法；【实验原理】1.在温度、pH及酶浓度恒定的条件下，酶促反应的初速度随底物浓度[S]增大而增加，但底物浓度增大到一定极限时，则反应速度趋于恒定，即最大反应速度（Vmax）。反应速度与底物浓度之间的关系可用米氏方程来表示，即：][][maxSKsVVm2.本实验以碱性磷酸酶为例，用磷酸苯二钠为其底物，生成酚和磷酸盐。酚在碱性溶液中与4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化生成红色醌的额衍生物，根据红色的深浅可测出酶活力高低。其反应如下：醌类衍生物（红色）氨基安替比林苯酚苯酚磷酸苯二钠OHCNFKOHAKPHPONaOH,)(42,2634e-【实验器材与试剂】器材：试管架，试管，移液管，移液枪，恒温水浴箱，721型分光光度计试剂：0.02mol/L底物液，pH=10碳酸缓冲液，蒸馏水，酶液，碱性溶液，4-氨基安替比林，铁氰化钾【实验步骤】试剂1234567空白0.02mol/L0.050.100.200.400.600.801.000.00底物液pH=100.900.900.900.900.900.900.900.90碳酸缓冲液蒸馏水0.950.900.800.600.400.200.001.00混合水浴37℃，预温5分钟酶液0.10.10.10.10.10.10.10.1（0.5mg/ml）加入酶液后立即混匀，37℃水浴保温，反应开始。并开始计时，反应时间为15min碱性溶液1.01.01.01.01.01.01.01.04-氨基安1.01.01.01.01.01.01.01.0替比林铁氰化钾2.02.02.02.02.02.02.02.0混匀，室温放置10min左右，以空白管调零，测定各管的吸光度（A510）时间步骤现象分析15:50配好底物混合液无明显现象并开始预热15:55预热结束并加入酶液无明显现象水浴15min16:07水浴结束，依次加入1-5号管红黄生成酚类碱性溶液等试剂，混颜色依次加深衍生物，匀，置于室温下10min6,7管颜色不深6,7号管反应未完全16:17测定各管吸光度【实验结果记录与处理】试管编号12345678A5100.0300.0530.0970.1580.2320.1190.1280.0数据处理试管编号12345678底物浓度0.51.02.04.06.08.0100mmol/L1/[S]210.50.250.1670.1250.1001/A51033.3318.8710.316.334.318.407.810以1/[S]为横轴，1/A510为纵轴作图：【计算】根据y=15.071x+3.3668，当y=0时，x=-0.2234，继而Km=2.61mmol/L【实践与思考】1.底物浓度变化对酶促反应速度可造成什么样的影响？在底物浓度很低时，反应速度随底物浓度的增加而急骤加快，两者呈正比关系，随着底物浓度的升高，反应速度不再呈正比例加快，反应速度增加的幅度不断下降。如果继续加大底物浓度，反应速度不再增加，此时，无论底物浓度增加多大，反应速度也不再增加，说明酶已被底物所饱和。所有的酶都有饱和现象，只是达到饱和时所需底物浓度各不相同而已。2.Km值在酶动力学研究中有什么意义？不同的酶Km值不同,同一种酶与不同底物反应Km值也不同,Km值可近似的反应酶与底物的亲和力大小：Km值大,表明亲和力小；Km值小,表明亲合力大.y=15.071x+3.3668R²=0.9561051015202530354000.511.522.51/A5101/[s]L/mmol1/A510与1/[S]函数图系列1线性(系列1)【注意事项】1.计算出来的Km值与查资料所得到的值有一定的差距。实验是粗测，本身存在实验误差，我们在操作过程中也造成误差，所以导致与实际值差距较大。2.各管温度的时间一致。分子筛层析（凝胶过滤法）【实验目的】1.掌握葡聚糖凝胶的特性及凝胶层析的原理；2.学习葡聚糖凝胶层析的基本操作技术。【实验原理】1.凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体，它们的内部有很细微的多孔网状结构。2.在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外，而小分子可以进入凝胶颗粒内部的多孔网状结构，流速缓慢，以至最后流出柱外，从而使样品中分子大小不同的物质得到分离。3.本实验采用葡聚糖凝胶G-25，以水为洗脱溶剂，层析分离大分子蓝葡聚糖（M200万）和小分子黄色重铬酸钾（M=294）。【实验仪器与试剂】仪器：层析柱，试管架，铁架台，试管，小烧杯，胶头滴管试剂：葡聚糖凝胶，蓝色葡聚糖，黄色重铬酸钾，蒸馏水【实验步骤】时间步骤现象分析打开柱的下口让水逐渐流出待到床面上只留下极薄的一层水时夹住出口管用胶头滴管吸取混合液，小心地将3~5滴此样品垂直加到凝胶床的表面上注意加样时勿将床面凝胶冲起，亦不要沿柱壁滴加样品，因为这样样品易从柱壁与凝胶床之间漏下打开出口管，待样品全部进入床后，关闭绿色混合液集聚在柱的下口，加入3cm水后，再打开柱的下胶体上罚，加水进行扩展洗脱混合液缓慢分离大分子较快加蒸馏水洗脱，用小量筒收集洗脱液上方为黄色，下方通过胶体小为蓝色分子较慢保持水位，直到分离结束【实验结果】123456789101112131415-------+++++++++++++---161718192021222324252627282930--+++++++++--------【曲线图】蓝色黄色1020试管编号【实验讨论】1.通过盐析法可将一些目的蛋白质沉淀下来，为了除去蛋白质中的盐离子，常采用SephadexG-25分子筛层析法脱盐；2.操作中应该注意的问题1)柱子要细，要长，越细越长越好，流速会变慢，时间会延长，因需要而异2)缓冲液一定要选好，常用的有磷酸，Tris-Hcl，Tris-甘氨酸，醋酸等。凝胶溶胀所用的溶液应与洗脱用的溶液相同，否则由于更换溶剂，凝胶体积会发生变化而影响分离效果。3)控制凝胶的流速，凝胶层析，流速一般不是很快，一般0.5～1ml/min，但也不能太慢，因为太慢有扩散现象，峰会很宽。应保颜色深浅证凝胶能充分的沉淀且分布的较均匀。4)装柱时注意柱压，柱压过大时填料会塌陷。5)样品的浓度和加样量的多少是影响分离效果的重要因素。样品浓度应适当大，但大分子物质的浓度大时，溶液的黏度也随之变大，会影响分离效果，要兼顾浓度与黏度两方面。加样量和加样体积越少分离效果越好，加样量一般为柱床体积的1%～2%，制备用量一般为柱床体积的20%～30%。