蛋白酶抑制剂的研究进展

蛋白酶抑制剂的研究进展郭川微生物专业，200326031摘要：自然界共发现四大类蛋白酶抑制剂:丝氨酸蛋白酶抑制剂、巯基蛋白酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂和酸性蛋白酶抑制剂，本文就各大类蛋白酶抑制剂的结构特点，活性部位的研究概况及其在各领域应用的原理及进展。关键词：蛋白酶抑制剂；结构；应用天然的蛋白酶抑制剂(ＰＩ)是对蛋白水解酶有抑制活性的一种小分子蛋白质,由于其分子量较小,所以在生物中普遍存在。它能与蛋白酶的活性部位和变构部位结合,抑制酶的催化活性或阻止酶原转化有活性的酶。在一系列重要的生理、病理过程中:如凝血、纤溶、补体活化、感染、细胞迁移等，PI发挥着关键性的调控作用,是生物体内免疫系统的重要组成部分。从Ｋｕｎｉｔｚ等最早分离纯化出一种ＰＩ至今,已有多种ＰＩ被发现,根据其作用的蛋白酶主要分以下几类:抑制胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等的丝氨酸蛋白酶抑制剂,抑制木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶等的巯基蛋白酶抑制剂,抑制胃蛋白酶、组织蛋白酶Ｄ等的羧基蛋白酶抑制剂、抑制胶原酶、氨肽酶等的金属蛋白酶抑制剂等。而根据作用于酶的活性基团不同及其氨基酸序列的同源性,可将自然界发现的PI分为四大类:丝氨酸蛋白酶抑制剂、巯基蛋白酶抑制剂(半胱氨酸蛋白酶抑制剂)、金属蛋白酶抑制剂和酸性蛋白酶抑制剂[1]。1结构与功能1.1丝氨酸蛋白酶抑制剂（SerineProteaseInhibitor,Serpin）丝氨酸蛋白酶抑制剂是一族由古代抑制剂趋异进化5亿年演变而来的结构序列同源的蛋白酶抑制剂。Sepin为单一肽链蛋白质。各种serpin大约有30％的同源序列，疏水区同源性高达70％。血浆中的serpin多被糖基化，糖链经天东酰胺的酰胺基与主链相连。位于抑制性serpin表面、距C端30～40个氨基酸处的环状结构区RSL（reactivesiteloop）中，存在能被靶酶的底物识别位点识别的氨基酸P1[2]；近C端与P1相邻的氨基酸为P1’，依此类推，即肽链结构表示为N端-P15～P9～P1-P1’～P9’～P15’-C端。在对靶酶的抑制中。Serpin以RSL中的类底物反应活性位点与靶酶形成紧密的不易解离的酶-抑制剂复合物，同时P1-P1’间的反应活性位点断裂。几种perpin氨基酸序列比较发现，serpins各成员的抑制专一性是由P1决定的，且被抑制的酶特异性切点一致。如抗凝血酶，抑制以Arg羧基端为敏感部位的丝氨酸蛋白酶，其中P1为Arg[2]。1.2巯基蛋白酶抑制剂（CytsteineProteinaseInhiitor，CPI）对于丝氨酸蛋白酶抑制剂(SPI)已有大量研究,巯基蛋白酶抑制剂(CPI)的研究则相对要晚一些。而动物和微生物来源的CPI已有一些研究,发现它们在结构上具有同源性,Barrett等将CPI统称为胱蛋白超家族,并按分子内二硫键的有无与数量,分子量大小等将此家族分为3个成员(F1、F2、F3)。在3个家族中,大多数F1和F3的CPI中都有Glu53-Val54-Val55-Ala56-Gly57保守序列,其同源序列在其它CPI中也被发现,如Ｆ2中的Gln-Ｘ-Val-Ｙ-Gly和CHα-ras基因产物中的Gln-Val-Val肽段。人工合成的Glu-Val-Val-Ala-Gly短肽也显示对木瓜蛋白酶有抑制活性,因此可以认为这一保守区段在抑制活性中起着全部或部分的关键作用[3]。对植物来源的ＣＰＩ研究的不多,已有报道的有水稻、鳄梨和大豆。水稻巯基蛋白酶抑制剂(Oryzacystatin,OC)具有102个氨基酸残基,有典型的Glu-Val-Val-Ala-Gly保守序列,应与动物CPI同源进化而来。从OCI没有二硫键来看,它应归为F1成员,但从序列比较看,则更接近F3。对OCIGlu---Gly保守序列进行点突变试验表明,突变使其抑制活性大幅度下降,其中当Glu被Pro替代时则活性全无,由此说明,这一段保守序列在OCI的抑制活性中,同动物CPI一样必不可少。除Glu---Gly保守区域外,OCI序列中其它区段对其功能也有影响。利用pUC18构建了不同的OCIＮ端、Ｃ端序列缺失的表达载体,进行原核表达,其产物以Ｎ-苯甲酰精氨酰-2-萘氨为底物,缺失试验表明,当Ｎ端缺失21个氨基酸残基或Ｃ端缺失11个氨基酸残基时,OCI同样具有显著的抑制活性,但当Ｎ端缺失至38个氨基酸残基或Ｃ端缺失至35个氨基酸残基时,则抑制活性显著下降,虽然这时缺失产物中仍含有Glu---Gly区段。[]因此认为OCI的抑制活性是其两端区域与Glu---Gly区段协同作用的。尤其是Ｎ端的Pro7可能形成一个特殊结构来阻止酶的水解,从而使抑制活性完全丧失。1.3金属蛋白酶抑制剂（metalloproteinaseinhibitor）基质金属蛋白酶(Matrixmetalloproteinases,ＭＭＰ)是锌金属蛋白酶的一族,对胞外基质的降解起着主导作用,与结缔组织的降解和重建有关。在体内通过特定的途径调节。若调节发生紊乱,将导致各种疾病的发生,如关节炎、肿瘤和组织溃烂等[5]。基质金属蛋白酶（MMPs）拥有一个共同的活性位点模式:三个组氨酸残基（His218,His222,His228）结合催化部位锌离子。Glu219,作为催化部位的广义酸碱催化剂;Ala182,其羰基氧与肽键的ＮＨ形成氢键;Leu181和Tyr240,其侧链组成一道“墙”将Ｓ1′和Ｓ3′隔开,并供一供体ＮＨ与底物形成氢键;Pro238和Ala234,其羰基指向Ｓ1′区域。从酶的三级结构来,MMP分子中包括3个α螺旋和4个平行、1个反行β折叠。从与底物或抑制剂作用的模式来看,分为两个部分:(1)Ｎ端催化部位;(2)酶的疏水区1,Ｓ1′,Ｓ2′,Ｓ3′。各种ＭＭＰ及其亚型在氨基酸序列的同源性很强,仅在局部区域有不同。这种差异要体现在酶的Ｓ1′疏水区[4,5]。ＭＭＰ抑制剂可分为组织抑制剂(Tissueinhibitorofmetalloprpteinases,ＴＩＭＰ)和合成抑制剂,TIMPs存在于多种组织中,它与肝纤维化的发生发展密切相关。目前已发现4种TIMP成员:TIMP1、TIMP2、TIMP3、TIMP4。TIMP1是一种分子量为29(2536)ｋｄ的蛋白质,其蛋白分子中包含184个氨基酸,其中含有12个高度保守的半胱氨酸残基,形成6个二硫键,把TIMP1分子分成两个结构域。TIMP1转录本长度为0.9ｋｂ。TIMP2与人TIMP1相同,它同样含有12个高度保守的半胱氨酸残基位点,并且有3/4的色氨酸残基与TIMP1相同,其转录本大小为1.0～3.5ｋｂ。TIMP3由188个氨基酸组成,也具有12个高度保守的半胱氨酸残基,其与TIMP1和TIMP2分别有28%和42%的同源性,但相互之间无免疫交叉反应,它与TIMP2均为非糖基化的蛋白质。TIMP3转录本大小为1.2～1.4ｋｂ。TIMP4是一种分子量为22.6ｋｄ的蛋白质,它最初是在心肌组织的分子研究中发现的,其转录本大小为1.2～1.4kb.1.4酸性蛋白酶抑制剂（acidproteinaseinhibitor）活性位点具有2个酸性氨基酸残基的酸性蛋白酶可以为许多疾病的治疗靶点。在分类广泛的酶的家族中，HIV-1已被证实是治疗AIDS的有效靶点，同时肾素引起高血压，组织蛋白酶D在乳腺肿瘤转移中起作用，血浆蛋白酶1和2型引起疟疾。比起蛋白类抑制剂，合成的小分子蛋白酶抑制剂作为药物具有不易被降解的优点和更高的生物有效性。[6]一个有效的设计酸性蛋白酶抑制剂的方法是结合一个能够模仿四面体对称中间体的等电子体，这个中间体是由蛋白酶催化酰氨键水解产生的。目前已合成的小分子蛋白酶抑制剂如下：2实际应用蛋白酶抑制剂是一种重要的生化药物和生化试剂，其来源广泛，普遍存在于动、植物和微生物中，因此在工业、农业及医药领域已经得到广泛的应用。2.1在植物抗病虫害方面的应用及研究当蛋白酶抑制剂被昆虫摄食并在体内积累时,它就会抑制肠道内蛋白水解酶的活性,并能刺激消化酶的过量合成和分泌,引起某些必需氨基酸(如甲硫氨酸)的缺乏,扰乱昆虫的正常代谢,最终导致昆虫发育不正常甚至死亡。因此,蛋白酶抑制剂在植物对害虫和病原体的侵染防御系统中具有十分重要的作用。[7]目前对于蛋白酶抑制剂的研究有相当一部分工作集中在转基因植物上,转基因技术已逐渐成为控制病虫害的有效工具。同使用大量农药的传统方法比较,通过转基因技术获得转基因作物具有对环境毒害小,成本低等优点,渐渐受到欢迎。2.2在饲料工业中的应用在饲料工业生产和畜禽饲养实践中,尤其是在用豆粕玉米型日粮饲养畜禽的条件下,如何防止胰蛋白酶抑制剂对畜禽的危害是国内外普遍关注的问题。目前国外的研究较多地集中在胰蛋白酶抑制剂的结构及其与靶酶的作用机理、胰蛋白酶抑制剂的基因表达等方面。国内近年对饲料中胰蛋白酶抑制剂的去除方法及其效果开展了一些研究,对生产实践起到了一定的指导作用。2.3在医药领域的应用2.3.1HIV1蛋白酶抑制剂(HIV1PI)HIV1基因编码的天冬氨酸蛋白酶对于gag和gagpol多聚蛋白的翻译加工、形成病毒核心的结构蛋白(P17,P24,P9和P7)以及其他基本的酶类如RT和IN本身都是必需的。HIV1蛋白酶抑制剂(PI)主要是作用于病毒蛋白酶,抑制HIVPR的活性,HIV在被感染的细胞中就会产生不成熟的不具感染性的病毒颗粒,从而达到使病毒不能正常装配,抑制HIV的目的。HIV1的蛋白前体在蛋白酶催化下,加工成为成熟蛋白,而PI可阻止前体蛋白酶的裂解,导致无感染病毒颗粒的堆积,达到抗病毒的效果。HIVPI的主要设计原理为：以HIV1PR切割HIV前体蛋白质上的位点序列为蓝本,设计并合成一系列个别位点突变的拟肽分子,即拟肽类HIV1PI,它们能与HIVPR结合,但不被水解,从而产生竞争性抑制作用,目前临床上应用的多为此类药物。[8]HIVPI除了在抗HIV方面发挥着重要作用之外，也有报导可抑制Kaposi恶性肿瘤、淋巴瘤生长等其他的作用。这些作用大多数是由于蛋白酶抑制剂能够抑制病毒对细胞的入侵、基质金属蛋白酶的活性等对肿瘤发生、感染和转移起关键作用的因素。所以HIVPI能够治疗在HIV感染者或非HIV感染者中的Kaposi和其他肿瘤。[9]2.3.2其他药用功能参与免疫调节：近年来,类胰蛋白酶被发现具有引起嗜酸性粒细胞和中性粒细胞在组织中聚集和激活、激活肥大细胞、诱导IL8释放和上皮细胞增生等功能,表明它是一种由肥大细胞分泌的炎性介质。[10]抗AD：早老性痴呆症（AD）与大脑中amyloidβ-protein（淀粉β蛋白，Aβ）的积累有关，而一系列蛋白酶作用于中amyloidβ-proteinprecursor（淀粉β蛋白前体，Aβpp）而形成Aβ的N端和C端，所以这些酶就可作为蛋白酶抑制剂的作用靶点从而达到治疗AD的目的。[11]治疗治疗急性胰腺炎：急性胰腺炎发病时,胰腺中的血清淀粉酶、溶酶体酶、组织蛋白酶Ｂ、苹果酸脱氢酶水平显著增加,溶酶体酶、组织蛋白酶Ｂ能激活胰蛋白酶原,后者激活许多其他的消化酶,从而导致胰腺的过度损伤。研究证明ＵＴＩ能抑制许多对急性胰腺炎起关键作用的酶,如胰蛋白酶、磷脂酶Ａ、胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶等,并能抑制溶酶体酶,稳定溶酶体膜,从而起到对胰腺外分泌部的保护作用[12]。参考文献[1]曲晓华,浦冠勤.蛋白酶抑制剂的研究与应用,蚕桑茶叶通讯,2003(1):19~21.[2]张梅,朱柞铭.丝氨酸蛋白酶的研究和应用,生物化学与生物物理学进展，1996,23(3):240~244.[3]孟昆,苏宁,沈桂芳.水稻巯基蛋白酶抑制剂研究进展,生物技术通报,2000(2):5~7.[4]Dove.金属蛋白酶抑制剂:临床失败中的希望之光,国外医学药学分册,2002,29(5):309.[5]葛轶昱.基质金属蛋白酶抑制剂研究进展,基质金属蛋白酶抑制剂研究进展,2001,28(1):18~22.[6]JinglanZhou,AndreasTermin,MelissaWayland,Solid-PhaseS