第六章-酶与细胞固定化

第一节酶的固定化第二节微生物、植物和动物细胞固定化第三节原生质体固定化第一节酶的固定化一、固定化酶的优缺点二、酶的固定化方法三、固定化酶性质四、固定化酶的应用酶的固定化：借助各种物理或化学方法，将酶固定于水不溶性载体上的过程。固定化酶(immobilizedenzyme)：固定在载体上并在一定空间范围内进行催化反应的酶。（固定化酶又叫水不溶性酶）什么是固定化酶？水溶性酶水不溶性载体水不溶性酶（固定化酶）固定化技术固定化酶的优点③可以反复使用，有利于工艺的连续化。②反应后易于分离，简化了提纯工艺，产物得率高，利于提高产品质量。①可提高稳定性④反应过程可以严格控制，有利于工艺自动化。⑤适应于多酶反应体系。一、固定化酶的优缺点固定化酶缺点缺点③比较适应水溶性底物和小分子底物。②固定化成本高。①酶固定化时酶的活力有所损失。二、酶的固定化方法1.吸附法2.包埋法3.共价偶联法4.交联法固定化方法吸附法结合法交联法包埋法网格型微囊型离子键结合法物理吸附法共价键结合法1、吸附法（1）定义：利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上。物理吸附法（physicaladsortion）作用力：氢键、疏水键常用载体：氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石、纤维素、大孔合成树脂等。优点：酶的活性中心不易被破坏，酶活力损失小。缺点：结合力弱，易解吸附。（3）制备方法：a.静态法(statiaprocedure)：没有搅拌、振摇情况下，将载体直接加入酶溶液，通过自然吸附、解吸、再吸附等过程、制备固定化酶。该法操作简便，但效率低，耗时，吸附量小且不均匀。b.电沉积法(electrodepositionprocedure)：在酶溶液中放置两个电极，在电极邻近加入载体，接通电源，酶移向电极并沉积到载体表面，以制备固定化酶。该法可提高吸附时局部浓度，增加吸附量，但要注意酶在电场中的稳定性。c.混和振摇装载法(mixingorshakingbathloading)：是实验室常用方法，载体与酶液混和后，要在搅拌下或摇床连续振摇下完成固定化。该法固定化较为均匀，要注意搅拌或振摇速率，既不破坏酶和载体结构，又要达到充分混和目的。d.反应器装载法(reactorloadingprocess)：这是工业上常用方法，它将固定化和其后的应用连在一起，即先将载体装于反应器中，再加上酶液，然后通过循环流振动方式使酶和载体达到充分混和。(1)定义：将酶分子包埋在各种多孔载体中，制成一定形状的固定化酶的技术，主要用于水溶性小分子底物转化反应。2、包埋法：(entrapment)(2)包埋法的类型：酶被包埋成网格型称为凝胶包埋法；酶被包埋成微胶囊型称为微胶囊包埋法。包埋过程不发生反应凝胶包埋法（网格型）：将酶包埋在凝胶内部的微孔中。微胶囊包埋法（微囊型）：将酶包埋在高分子半透膜中。a.凝胶包埋：凝胶包埋条件酶活性强度天然凝胶琼脂、海藻酸钙、角叉菜胶、明胶温和不变差合成凝胶聚丙烯酰胺、光交联树脂聚合反应部分失活高使用的多孔载体及其特点海藻酸钙凝胶包埋法：滴至海藻酸钠溶液＋E(orcell)CaCl2溶液中IE(orIC)角叉菜胶包埋法：滴至角叉菜胶＋E(orcell)KCl溶液中IE(orIC)聚丙烯酰胺凝胶包埋法：过硫酸钾Acr+Bis+E(orcell)IE(orIC)二甲氨基丙腈b.微囊型包埋(microencapsulation)：又称半透膜包埋法：将酶包埋于由各种高分子聚合物（直径几十微米～几百微米，厚约25mm的半透膜）制成的小球内，制成固定化酶。①常用半透膜有：聚酰胺膜、火棉胶膜②制备方式：界面沉降法、界面聚合法、表面活性剂乳化液包埋法。分述如下：界面沉降法：利用高聚物在水相和有机相的界面上溶解度降低而凝聚，易形成皮膜而将酶包埋于中。例：以火棉胶（硝酸纤维素）包埋酶时，先将酶的水溶液在含有硝酸纤维素的乙醚溶液中乳化、分散，然后再加入苯甲酸丁酯，促使硝酸纤维素在酶液液滴周围凝聚，最后用Tween20破乳化后，就可得到含酶的火棉胶囊。界面聚合法：将疏水性和亲水性单体在界面进行聚合，形成半透膜，使酶包埋于半透膜微囊中。例：以尼龙膜包埋酶时，将酶液及亲水性单体（如己二胺）溶于水制成水溶液。另外，将疏水性单体（癸二酰氯等）溶于氯仿或甲苯等与水混溶的有机溶剂。然后，将这两种互不相溶的液体混和在一起。加入乳化剂乳化，使酶液分散成小液滴。此时，亲水性的已二胺与疏水性的癸二酰氯就在二相界面聚合成半透膜，将酶包埋在小球内。再加Tween—20，使乳化破坏，用离心分离即可得用半透膜包埋的微囊型固定化酶。表面活性剂乳化液膜法：在酶的水溶液中添加表面活性剂，使之乳化形成液膜达到包埋的目的。该法不含化学反应，简便，而且固定化是可逆的，但有渗漏的可能性。脂质体包埋：将酶包埋于脂质体(Liposome)中的方法。脂质体是指具有脂双层结构和一定包囊空间的微球体。脂质体包埋的特点：具有一定的机械性能，能定向将酶等被包裹物携带到体内特定部位，然后将被包裹物质释放。因此，其在药物应用方面受到重视。与凝胶包埋法相比，微囊型包埋法的优点：1）固定化酶颗粒小。2）半透膜能阻止蛋白质分子渗漏和进入，注入体内既可避免引起免疫过敏反应，也可使酶免遭蛋白水解酶的降解，具有较大的医学价值。缺点：反应条件要求高,制备成本也较高。包埋法是目前应用最多的一种较理想的方法，与其它固定化方法相比：•优点：不与酶蛋白氨基酸残基反应，很少改变酶的高级结构，酶活回收率高。•缺点：只适合作用于小分子底物和产物的酶。1）离子结合法（ionbinding）作用力：离子键常用载体：DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶、CM-纤维素3.结合法载体通过共价键或离子键与酶结合的固定化方法。1）离子结合法（ionbinding）作用力：离子键常用载体：DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶、CM-纤维素优缺点：催化效率损失小；结合力弱，改变pH和离子强度可使酶脱落。借助共价键将酶的活性非必需侧链基团和载体的功能基团进行偶联。2）共价结合法A.载体：亲水载体优于疏水载体如:天然高分子衍生物:纤维素葡聚糖凝胶亲和性好，机械性能差琼脂糖合成聚合物：聚丙烯酰胺聚苯乙烯机械性能好，但有疏水结构尼龙亲水性好，有一定机械强度2）偶联方法：芳香氨基羟基羟甲基氨基载体上的功能基团酶分子上的非必需侧链基团游离氨基胍基酚羟基巯基咪唑基羟基重氮法叠氮法卤化氢法烷化法缩合法常用的偶联反应①重氮法：这是带芳香氨基载体的主要反应，即载体先用亚硝酸处理成重氮盐衍生物，然后再在温和的条件下和酶分子上相应的基团如酚羟基、咪唑基或氨基直接进行偶联。（见示意图）例如对氨基苯甲基纤维素可与亚硝酸反应R—O—CH2—C6H4—NH2+HNO2R—O—CH2—C6H4—N+＝N+H2O载体活化后，活泼的重氮基团可与酶分子中的酚基或咪唑基发生偶联反应值得固定化酶。R—O—CH2—C6H4—N+===N+ER—O—CH2—C6H4—N＝N—E亚硝酸可由亚硝酸钠和盐酸反应生成：NaNO2+HClHNO2+NaCl②叠氮法：含有酰肼基团的载体可用亚硝酸活化，生成叠氮化合物。以羧甲基纤维素为例，先将羧甲基纤维素甲酯化，再与肼反应生成羧甲基纤维素的酰肼衍生物，然后再与亚硝酸反应得到叠氮化合物，这种产物能在低温、pH7.5—8.5的情况下和酶的氨基直接偶联。叠氮衍生物也能和羟基、酚羟基或巯基反应。R—O—CH2—COOH+CH3OHR—O—CH2—COO—CH2+H2OCMCCMC甲酯R-O-CH2-COO-CH2+NH2-NH2R-O-CH2-CO-NH-NH2+CH3OHCMC甲酯肼CMC酰肼衍生物R—O—CH2—CO—NH—NH2+HNO2R—O—CH2—CO—N3+2H2OR—O—CH2—CO—N3+H2N—ER—O—CH2—CO—NH—ER—O—CH2—CO—N3+HO—ER—O—CH2—CO—O—ER—O—CH2—CO—N3+SH—ER—O—CH2—CO—S—E③溴化氰法(常用)：带羟基的载体如纤维素、葡聚糖和琼脂糖等常用的反应。在碱性条件下载体羟基和溴化氰反应生成极活泼的亚氨碳酸基，它在弱碱中可直接和酶的氨基进行共价偶联反应。④烷基化法：含羟基的载体也可在碱性条件下和均三氯三嗪(triazinyl)等反应，在引入活泼的卤素后能直接与酶的氨基、酚羟基或巯基等偶联。⑤缩合法：利用羰二亚胺的活化作用，使氨基与羧基直接偶联缩合成肽键的反应，适用于带羧基或氨基的载体。•优点：酶与载体结合牢固，不会轻易脱落，可连续使用。•缺点：反应条件较激烈，易影响酶的空间构象而影响酶的催化活性。4.交联法（crosslinking）借助双功能试剂使酶分子之间、酶分子与惰性蛋白或酶分子与载体间发生交联，形成共价键连接来制备固定化酶的方法。双功能试剂：常用的是戊二醛戊二醛有两个醛基，均可与酶或蛋白质的游离氨基反应,使酶蛋白交联。此法与共价偶联法利用的均是共价键。在没有其它载体参与，仅通过酶分子间交联形成的固定化酶，颗粒很小，而且机械性能不佳，为克服这一缺点，一般可先将酶吸附于载体上，或者包埋于胶内或微囊内，然后再交联制成固定化酶“网”膜或“网”颗粒。这种方法又称为双重固定化法。交联反应既能发生在分子间，也可发生在分子内。•酶浓度低时，交联发生在分子内，酶仍保持溶解状态（修饰）。•酶浓度高时，交联发生在分子间，酶变为不溶态（固定化）。缺点：(1)反应条件激烈，酶分子的多个基团被交联，酶活力损失大。(2)制备的固定化酶颗粒较小，给使用带来不便。优点：制备简单、结合牢固、可以长时间使用。酶和细胞固定化示意图固定化方法物理吸附法包埋法离子结合法共价结合法交联法制备难易易较难易难较难结合程度弱强中等强强活力回收高，酶易流失高高低中等再生可能不能可能不能不能费用低低低高中等底物专一性不变不变不变可变可变各种固定化方法的优缺点比较固定化方法物理吸附法包埋法离子结合法共价结合法交联法制备难易易较难易难较难结合程度弱强中等强强活力回收高，酶易流失高高低中等再生可能不能可能不能不能费用低低低高中等底物专一性不变不变不变可变可变各种固定化方法的优缺点比较三、固定化酶的性质酶分子经固相化后，从游离态变为结合态。酶分子处在一个与游离态酶完全不同的微环境中，微环境的许多性质会影响酶原有的性质。1.活力：大多数酶固定化后，酶活性下降。原因：（1）构象改变；（2）空间位阻（3）活性中心与载体结合评价固定化酶的指标：相对活力低于75%，没有实际应用价值。2.稳定性：(4)对变性剂的耐受性提高，在尿素、有机溶剂和盐酸胍等蛋白质变性剂的作用下，仍可保留较高的酶活力等。(1)对热的稳定性提高，可以耐受较高的温度。对酸碱耐受力增强。(2)固定化后半衰期增长，保存稳定性好。(3)对蛋白酶的抵抗性增强，不易被蛋白酶水解。影响原因：①固定化增加了酶活性构象的牢固程度，并且固定化后酶分子与载体多点连接，可防止酶分子伸展变形。②抑制酶自身降解，酶与载体固定化后失去了分子间相互作用的机会，从而抑制了其自身的降解过程。③固定化部分阻挡了外界不利因素对酶的侵袭，但是如果固定化触及到酶的活性部位或调节部位，也可能导致酶稳定性下降。3.最适反应pH：酶经固定化后，其作用的最适pH常会发生偏移，影响固定化酶最适pH的因素：(1)载体性质对最适pH影响：带负电荷载体：最适pH向碱性偏移。带正电荷载体：最适pH向酸性偏移。不带电荷载体:最适pH一般不改变。(2)产物性质对最适pH影响；酶催化反应产物为酸性：最适pH向碱性偏移。酶催化反应产物为碱性：最适pH向酸性偏移。酶催化反应产物为中性：最适pH不改变。影响原因：固相酶颗粒在水溶液中，是被一层几乎不流动的液体包围着，这层不流动液体叫做扩散层。载体的带电性质之所以会影响固定化酶的最适pH值，是由于在使用带负电荷的载体时，载体会吸引反应液中的氢离子(H+)到其附近，致使固定化酶所处反应区域的pH值比周围反应液的pH值低一些，这样就必须把反应液的pH值提高一些，才能使酶充分发挥其催化功能。故此，固定化酶的最适pH显得比游