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API4000串联四级杆质谱仪基础培训龚楚婷一、API4000基本结构1、整体图2、Agilent液相样品引入系统（自动进样器器、针泵）3、离子源1、API4000基本结构1、API4000基本结构样品引入离子化质量分析2、液相-Agilent1200系列溶剂箱真空脱气机二元泵自动进样器恒温箱柱温箱自动进样器69167131254样品引入方法连续进样，针泵推样品，提供准确的低流速。允许连续的样品引入以便仪器的调谐和优化。分流进样，使用针泵和LC系统化离子源和化合物参数。流动注射进样（FIA）,没有柱子的情况下，使用LC高通量的优化液相参数。液相色谱，使用LC在宽的流速范围下，分离、分析混合物辅助气加热头TISorAPCI离子探头液体进入口垂直精密调节旋钮水平精密调节旋钮两通或三通离子源排气口喷雾针出口APCI电晕针3、离子源3.1离子源体•离子源体是TIS和APCI共用的,TIS和APCI的互换不用工具,只用手就可以完成.•放电针位置调节钮,单手操作即可•放电针一直在离子源体内3.2probeTurbolonsprayprobeAPCIprobe二、基本知识1、选择合适的离子源2、仪器接口3、离子传输通道4、离子检测器1、选用合适的离子源电喷雾-TurboIonSprayTIS工作原理同EI,不同的是TIS有辅助加热气(GS2),可加快去溶剂的速度可用于比较大的液体流量缺点：基质抑制现象较为明显；放电现象APCI三步离子化的过程:1.电晕针放电使离子源内的N2或O2带电2.N2或O2转移电荷到气态溶剂分子上3.带电的气态溶剂分子转移电荷到气态样品上适合分析分子量小于2000Da的样品缺点：有可能发生热裂解；大气压化学电离源(APCI)又叫:加热雾化源HeatedNebulizerTurbolonSpray离子源•针电压•正离子：1500到5500V•负离子：-1500到-4500V•温度（TEM）•高流速需要高的温度，最高到750度•流速•10-3000μL/min最优化：200-500μL/min•溶剂•在正离子模式下，铵盐的浓度在2-10mmol/L，在负离子模式下为2-50mmol/L。•酸性添加剂的浓度为0.1%-0.5%参数优化高含水比例的流动相需要更高的温度和气流，离子源温度太低时易形成溶剂簇离子气帘气在不影响灵敏度的前提下可设定较高值，保障仪器的抗污染及方法的重现性APCI加热喷雾器指南•加热喷雾器是高流速入口•电晕针位置：稍偏离探针，对准孔•缓冲液/添加剂不需要离子化•挥发性缓冲液最高50mM•极性大的化合物可能降低极性低的化合物的灵敏度，比如TFA正离子模式下从分析物那里夺走电荷•流速：0.1-3mL/min最优化：*-1mL/min参数优化2、API4000仪器的接口流速大时，增大curtaingas，抗污染、助汽化3、API4000的离子传输通道DP：加在小孔板上的电压，用于打断样品离子与溶剂分子间的化学键，使样品离子分离出来EP：加在Q0上的电压，聚焦离子束，调节离子束能量和速度DF：离子束偏转电压，加在检测器前方使离子束进入检测器CEM：检测器放大电压，有最佳值，电压数值越大检测器寿命越短常见的加合离子正离子方式常出现如下离子:•-Na22Da.higherthanM+H•-K38Da.higherthanM+H•-Li9Da.higherthanM+H•-NH417Da.higherthanM+H•-ACN40Da.higherthanM+H•2M+H,2M+Na等负离子方式常出现如下离子:•-TFA114Da.higherthanM-H(113and227background)•-Acetate60Da.higherthanM-H•-Formic46Da.higherthanM-H•-Cl36Da.higherthanM-HLC-MS中常见的本底离子•••••••••m/z15-150,溶剂离子，[(H2O)nH+，n=3-112]m/z102,H+乙腈+乙酸,C4H7NO2H+,102.0549m/z149,管路中邻苯二甲酸酯的酸酐,C8H4O3H+,149.0233m/z288,2mm离心管的产生的特征离子m/z279,管路中邻苯二甲酸二丁酯C16H22O4H+,279.1591m/z316,2mm离心管的产生的特征离子m/z384,瓶的光稳定剂产生的离子m/z391,管路中邻苯二甲酸二辛酯,C24H38O4H+,391.2843m/z538,乙酸+氧+铁（喷雾管）,Fe3O(O2CCH3)6,537.8793三、仪器使用1、开机2、Analyst软件基本操作3、关机4、操作注意事项、日常维护1、开机1.开气：ExhaustGas、CurtainGas、Gas1/Gas2，压力约为0.4bar、0.4bar、0.6bar。2.打开机械泵上的电源开关，机械泵继续工作至少15分钟。3.打开仪器电源主开关（主机右侧），涡轮分子泵开始运行，抽真空。4.等系统真空到达1-2x10-5Torr（Analyst软件右下角的质谱图标有显示）后才可以正常操作仪器扫描。5.打开空气压缩机。6.打开电脑开关，进入Windows桌面，双击Analyst，进入Analyst分析界面。注意：以上操作程序适用于停机时间少于24-48小时的仪器或配置TW700分子泵的API4000在仪器安装或TW700分子泵更换后的首次开机操作。2、Analyst软件基本操作2.1软件使用者界面2.2软件模块2.3常规定量分析流程2.4不定期做质量校正2.5柱后灌流—介质效应2.6抬针2.7信噪比2.8采样点数2.9计算器2.10overlay2.11添加时间段和实验2.12工具栏常用图标2.1Analyst软件使用者界面模块列表项目目录导航条系统状态2.2软件模块•Configure(配置)–设置硬件、安全和报告配置•TuneandCalibrate(调谐)–手动、自动校准仪器和调谐方法•Acquire(采集)–设置采集方法和批文件的建立•Explore(浏览)–处理数据文件•Quantitate(定量)–数据定量2.2.1配置模块安全性配置硬件配置报告模板编辑2.2.1.1配置模块–安全2.2.1.2配置模块–硬件•创建仪器配置的硬件文件•加上不同的外围设备和其他应用•每个设备独自建立2.2.1.3配置模块–报告模板1、header、footers设计各分6个areas，上下及左中右可设定fonts、justification2、pagesetup页面设定3、单击选择修改的区域4、选左边列表的项目5、单击将项目送达或移除选中保证使用者可以在各自的项目中调用此模板12345竖直水平2.2.2调谐模块可用为:•调谐仪器•检测方法•手动采集•检测LC流速和背景2.2.3采集模块InformationDependentAcquisition编辑采集方法编辑采集序列快速审阅2.2.3.1浏览模块—处理数据文件2.2.4定量模块建立定量方法定量结果列表2.3常规定量分析流程新建Project2.3.1激活硬件此处激活MSONLY优化完质谱参数后，deactivateMSONLY，激活LCMS，优化其他参数2.3.2流动注射设置确认运行喷雾针垂直距离设为5-7cm正离子：5ml/min负离子：10ml/min2.3.3Q1SCAN——确定母离子的质荷比•根据待测化合物性质，选择分析的极性(＋/－)、离子化方式(ESI/APCI)，根据分子量选择扫描范围和时间•确定母离子的质荷比，准确到小数点后一位。•参数设置：•扫描方式：Q1Scan•质量范围：–ParameterRange，100～MW+30，t=1～2sec(200Da/s)–CenterWidth，MW±5Da，t=0.5sec•通过手动调节DP、EP，使喷雾平稳、有效确定母离子流动注射泵进样，调谐模式manualtuning，先parameterrange确定母离子范围，再centre/width确定精确m/z值信号强度在2e5到1e6之间，波动在15%以内比较合适点击Acquire采集Q1单级质谱数据并存盘，取名：样品名（英文）-SCAN多个母离子可以选Q1MultipleIons信号强度不要低于e4，不要超过e6，否则损伤电子倍增管，减少寿命！扫离子一般200Da/s，也可以适当减少每秒扫描次数，增加扫描准确度。提供扫离子的图：优化参数-结果2.3.4ProductIonScan--确定子离子的质荷比•得到高质量的MS图，母离子的强度为图谱中基峰强度的1/3到1/4为宜•平滑后选择子离子质荷比，确定到小数点后一位（允许有0.2Da的误差）•参数设置•扫描方式：ProductIonScan•质量范围：–ParameterRange，50～MW+10，t=1～2sec•通过手动调节CE、CXP确定子离子MCAON，Acquire采集数据并存盘取名：样品名-PI2.3.5优化化合物参数•根据前面选出的母、子离子，组建MRM离子对•选择多个离子对时，应合理分配每一对的分析时间•用“Ramp”，优化Compound项下各参数，以及Source项下CAD、CUR、GS1、GS2、IS、TEM、InterfaceHeater参数。各离子对应分别设定。•初步建立MRM方法•一般优化两次，以得到比较确切的结果把混合物中的所有离子对输入MRM方法中存盘，优化过程完成2.3.6方法转化：将连续进样方法→LC-MS方法将HPLC系统连接好，不接柱子，不连流动注射泵，将液相色谱泵与TIS离子源连好关掉所有质谱分析界面，将现有质谱体系灭活，激活液质联用设备，在调谐的模式下。单击Acquire中BuildAcquireMethod，打开上面保存过的MRM方法，添加设备：色谱泵、自动进样器等。设置色谱同步。设置色谱参数，分析时间一般为0.6～1min，流动相组成和流量与实际样品分析时相同；修改质谱分析时间，与色谱参数一致；设置GS1、GS2、TEM初始值为40、40、400左右，保存方法，例如：LC-MRM.dam。连液相，优化2.3.7FIA-优化Source参数•将前面用过的样品溶液稀释100～1000倍。•在Tune项下，双击CompoundOptimization，选择FIA分析•根据向导进行自动优化。不接色谱柱进行FIA定量优化•注意：需要优化的各可选值之间用“;”分隔。•当对源参数含义及设置比较清楚后，可以省略此步。FIA优化参数2.3.8色谱条件优化•接好并平衡色谱柱，用适当浓度标准品考察分离情况•根据色谱分离情况，设定梯度洗脱(平衡较慢)•MRM方式可以不必所有峰都基线分离，但要注意避开基质离子抑制的干扰•调整色谱流动相组成和流速，并相应调整源参数•••••空白基质添加标准品，稀释成不同浓度根据LC流动相组成，选择稀释液，配制实际样品编辑批处理文件，排列进样顺序平衡MS离子源和色谱柱LC-MS/MS采集数据2.3.9标准工作曲线的制备创建采集批文件-1选中，右键filldown或autoincrement创建采集批文件-2把批文件表格转换成ExcelQueuemanagerStartsample，stopsample，abortsample，stopqueue，nextsample，equilibrate，standby，ready••标准曲线的制做正确积分色谱图最后结果的打印、存贮、复制2.3.10数据处理a.打开图谱b.定量模式：AnalystClassicc.建立定量方法保存方法cps=countspersecondd.定量指南可以把ResultsTable输入Excele.积分f.回归添加/删除数据标准曲线关闭窗口g.拷贝也可以直接在文件夹里复制D://AnalystData/Project/h.打印-图谱、ResultsTable选择打印模板、页数、布局、打印机等信息打印–4个打印选择•打印栏–打印正选中的栏•打印窗口–一张纸上打印包含所有栏的窗口•打印Works