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第七章原核生物基因表达调控机体可以在基因表达过程（DNA到蛋白质）的任何阶段进行调控，一般以转录水平上的调控为主。第一节基因表达调控的基本概念1.反式作用因子与顺式作用元件基因表达的产物(蛋白质或RNA)从合成的场所扩散到目标场所而发挥作用的过程称为反式作用（trans-acting），此基因表达产物被称为反式作用因子（trans-actingfactor）。反式作用因子通常为蛋白质或RNA，其特征为可以从合成地扩散到目标场所发挥作用。顺式作用元件（cis-actingfactor）是指对基因表达有调节活性的DNA序列，其活性只影响与其自身同处在一个DNA分子上的基因。顺式作用元件通常不编码蛋白质，多位于基因旁侧或内含子中。顺式作用（cis-acting）的概念用于任一不转变为任何其他形式的DNA序列，它只在原位发挥DNA序列的作用，仅影响与其物理上相连的DNA序列的活性。基因活性的调控主要通过反式作用因子（通常是蛋白质）和顺式作用元件（通常在DNA上）相互作用而实现。2.结构基因和调节基因结构基因（structuralgene）是编码蛋白质或RNA的任何基因。结构基因编码大量的功能各异的蛋白质，如组成细胞和组织的结构蛋白和酶等。调节基因（regulatorgene）仅指参与其他基因表达调控的RNA和蛋白质的编码基因。调节基因编码的调节物通过与DNA上的特定位点结合而控制受调节基因的转录是基因表达调控的关键。3.启动子和终止子位于转录单位开始和结束位置上的DNA序列，称为启动子（promoter）和终止子（terminator）。两者都是典型的顺式作用元件，能受同一类反式作用因子RNA聚合酶的识别。4.操纵基因和阻抑蛋白操纵基因（operator）是与启动子相邻的顺式作用位点，是阻抑蛋白的靶点。阻抑蛋白（repressor）是调节基因的产物，与操纵基因的结合可以阻止受调节基因的表达。当阻抑蛋白与操纵基因结合时，就会阻止RNA聚合酶启动转录，基因的表达就被关闭。在无阻抑蛋白时，RNA聚合酶可以识别受调节基因的启动子，使这种基因得到表达。5.转录因子转录因子（transcriptionfactor）是转录起始过程中RNA聚合酶所需要的辅助因子。转录因子是参与正调控的反式作用因子，在无转录因子时，RNA聚合酶不能起始转录。转录因子通常识别位于基因上游启动子附近的顺式作用元件。操纵子（operon)顺式作用元件（cis-actingelement）结构基因（structuralgenes）调节基因（regulatorgenes）。反式作用因子（trans-actingfactor）。诱导物（inducer）和效应物（effectors）可诱导的基因和组成型基因控制位点（controllingsite）诱导（induction）第二节转录水平的调控原核生物的基因调控可以发生在转录和翻译等不同阶段，但也是以转录水平为主。原核生物许多功能相关的结构基因，特别是编码同一代谢途径的酶的基因，一般成簇排列，能受单一启动子的共同控制，结果是整簇基因或者都表达或者都不表达。1961年，Jacob和Monod提出了细菌基因表达调控的模型——操纵子学说，解释了原核生物的基因表达在转录水平上是如何调控的。操纵子（operon）就是由操纵基因（operator）以及相邻的若干结构基因所组成的功能单位。操纵子还包括一个结合RNA聚合酶的启动子。操纵基因是位于操纵子前端部分的顺式控制元件，它能和阻抑蛋白结合，控制结构基因的转录。阻抑蛋白是调节基因的表达产物，是参与操纵子调节的反式作用因子。原核生物操纵子中的全部结构基因从同一个启动子开始转录成单个mRNA分子。细菌应答某种特定物质出现而合成特定酶的过程，称为诱导作用（induction）。大肠杆菌乳糖操纵子是这种机制最好的范例。如果某种小分子物质能够促使细菌产生酶将其自身分解，这种小分子物质就叫做诱导物（inducer）。一、诱导作用和阻抑作用异丙基硫代-β-D-糖苷（IPTG）虽然不能被β-半乳糖苷酶分解，但它是乳糖操纵子非常有效的诱导物。这种能诱导酶合成，但不能被酶分解的分子称为义务诱导物（gratutiousinducer）。义务诱导物由于能在细胞内保持原型不变，因此很有用处，而真正的诱导物会被代谢分解掉。细菌快速应答环境营养成分的变化的能力不仅表现在分解新底物方面，而且也用来关闭突然在培养基中的化合物的内源性合成，这种效应就是所谓的阻抑作用（repression）。大肠杆菌色氨酸操纵子即是阻抑作用的例子。如果某种小分子物质能够阻止细菌产生合成其自身的酶，这种小分子物质叫做辅阻抑物（corepressor）。诱导作用和阻抑作用都能对细菌的代谢能力进行调控。前者调节细菌使用某种物质的能力，后者调节合成特定代谢中间产物的能力。每种调节的诱发剂都是小分子物质，或为酶的底物，或为酶所催化合成的产物。诱导物或辅阻抑物的作用是高度特异的，仅有特定的或密切相关的分子能发挥作用。但这些小分子并不直接与其调控的目标酶分子相互作用而实现其调控功能。正调控和负调控正调控负调控诱导(induction)阻遏(repression)诱导物(inductor)阻遏物(repressor)辅阻遏物(corepressor)使阻遏蛋白具有活性或使活性蛋白失去活性的物质称～。负调控正调控LacOAraO诱导失活的阻遏物活化的激活蛋白阻遏物诱导物失活的活性蛋白诱导物阻遏诱导阻遏诱导TrpO阻遏失活的活性蛋白辅-阻遏物活化的激活蛋白辅-阻遏物失活的活性蛋白诱导阻遏诱导阻遏图16-1原核生物结构基因的4种表达调控类型(仿B.Lewin:《GENES》Ⅵ,1997,Fig.12.21)未发现二、乳糖操纵子1乳糖操纵子与负控诱导系统乳糖操纵子（lactoseoperon，lac）的三个结构基因成簇排列，编码参与β-半乳糖苷（如乳糖）分解代谢所需的三种蛋白质：lacZ编码β-半乳糖苷酶，lacY编码β-半乳糖苷透性酶，lacA编码β-半乳糖苷转乙酰基酶。lacI基因（调节基因）正好与结构基因相邻，但它不与结构基因属于同一转录单位，它有自己独立的转录单位，含有自己的启动子和终止子。lacI编码可扩散的产物，理论上它不必位于结构基因附近。将lacI基因转移到其他任何地方都能很好地发挥作用，因此lacI的表达产物属于反式作用因子。lacI基因的表达产物称为乳糖操纵子阻抑蛋白（lacrepressor）。它的功能是阻止结构基因的表达。因此，乳糖操纵子的调控属于负调控。阻抑蛋白与lacZYA基因簇开始处的操纵基因（Olac）结合，阻止RNA聚合酶在启动子的转录起始而发挥作用。实际是一个抗解链蛋白，阻止形成开放结构。Operatormutationsareconstitutivebecausetheoperatorisunabletobindrepressorprotein；thisallowsRNApolymerasetohaveunrestrainedaccesstothepromoter.TheOcmutationsarecis-acting，becausetheyaffectonlythecontiguoussetofstructuralgenes.MutationsthatinactivatethelacIgeneoperontobeconstitutivelyexpressed,becausethemutantrepressorproteincannotbindtotheoperator.阻抑蛋白的作用机制1.阻抑蛋白及其靶DNA序列的对称性阻抑蛋白识别位点的共有特点就是具有对称性。靠近对称轴的一对反向重复序列在阻抑蛋白结合过程中起主要作用。阻抑蛋白的结构也具有对称性。阻遏蛋白的结构：N端1～59aa－头部片段：为HTH，与操纵基因DNA的大沟结合；核心区：有6个折叠，诱导物就结合在两个核心区之间的裂缝中；C端为两组亮氨酸拉链，形成四聚体。Helix-turn-helixCoredomain1Coredomain215180360DNAbindingHingeInducerbindingOligomerization图16-阻遏蛋白单体的结构和功能2.阻抑蛋白结构与功能的关系乳糖操纵子的阻抑蛋白为两个二聚体结合在一起形成的四聚体结构。四个亚基的螺旋连在一起，维持四聚体结构。每个二聚体都有两个头段，两个头段在一起结合一个操纵基因序列。这使整个阻抑蛋白能够同时结合操纵基因的两个位点。完整的四聚体阻抑蛋白能够同时与操纵基因结合，亲和力较不完整的阻抑蛋白高很多。与诱导物结合可直接引起阻抑蛋白构象发生改变，使两个二聚体的头段不再同时与DNA结合，使多亚基阻抑蛋白失去优势，降低了与操纵基因结合的亲和力。3.阻抑蛋白对RNA聚合酶功能的影响阻抑蛋白和RNA聚合酶可同时与DNA结合，而且阻抑蛋白与DNA的结合能够增强RNA聚合酶结合DNA的能力，但是结合着的RNA聚合酶不能起始转录。加入诱导物以后，释放出阻抑蛋白，被关闭的复合物转变为开放的复合物，起始转录。诱导物的结合解离模型(a)(b)图16－10诱导物作用模型。(a)平衡模型，诱导物与游离的阻遏物结合，打破了其游离与结合之间的平衡；(b)解离模型，诱导物直接与结合在操纵位点上的阻遏物结合，使其释放(仿B.Lewin:《GENES》Ⅵ,1997,Fig.12.13)诱导物和阻遏蛋白结合的模型维持阻遏过量的阻遏物可结合在DNA阻遏物结合在的其它位点操纵基因上aaaaaaaaa诱导物a诱导所有的阻遏物都结合aa在DNA的随机位点上aaaaa诱导物解离a建立阻遏阻遏物恢复活性状态aaa阻遏蛋白通过直接取代a从随机位点移向a操纵基因aaaaaa图16-14在细胞中所有的阻遏蛋白都结合在DNA上(仿B.Lewin:《GENES》Ⅵ,1997,Fig.12.18)StartpointgalaroHtrptrpRlacPromoterOperatorlocation图16-13操纵基因可位于启动子不同的相对位点乳糖操纵子同样存在正调控。在没有诱导物存在的情况下，存在lac操纵子的本底水平的表达。2cAMP对乳糖操纵子转录的激活作用细菌在富含葡萄糖的培养基上生长的时候，葡萄糖可以抑制β-半乳糖苷酶表达的一个很重要的因素是葡萄糖降低了细菌体内cAMP的水平。生化和遗传学实验证明，cAMP可以结合到启动子的某个部位而激活操纵子的转录。在细菌中，cAMP与CAP（cataboliteactivatorprotein，CAP）二聚体结合形成二元复合物共同发挥作用。只有cAMP存在时，CAP才有活性。CAP是一个正调控因子，在依赖CAP的启动子上起始转录必须有CAP参与。cAMP下降，CAP就不能与控制区结合，RNA聚合酶就不能启动转录。CAP激活转录有两种方式：第一种方式是直接作用于RNA聚合酶。CAP直接作用于RNA聚合酶的α亚基，而且CAP必须与RNA聚合酶在同一个面上才有活性。另一种是作用于DNA改变其结构，以协助RNA聚合酶的结合。在CAP-DNA复合物中，DNA呈弯曲状态，弯曲点位于二重对称的中心。CAP结合以后，DNA双螺旋结构有很大的变化。CAPBindingBendsDNAvThisDNAbendingresultsinmoreefficientRNApolymerasebindingCABSummaryA:RNApolymeraseB:lacrepressorC:CRP-cAMP协调调节※当阻遏蛋白封闭转录时，CAP不发挥作用；※如无CAP存在，即使无阻遏蛋白与操纵序列结合，操纵子仍无转录活性。单纯乳糖存在时，细菌利用乳糖作碳源；若有葡萄糖或葡萄糖/乳糖共同存在时，细菌首先利用葡萄糖。葡萄糖对lac操纵子的阻遏作用称分解代谢阻遏(catabolicrepression)。三