分子生物学-2转录与转录后加工

transcriptionandpost-transcriptionalprocessing(转录和转录后加工)主要内容•转录•概述•原核生物RNA聚合酶•原核生物转录过程•真核生物转录特点•真核生物基因的启动子及转录起始复合物的组装•转录后加工•rRNA前体的加工•tRNA前体的加工•mRNA前体的加工•RNA的自我剪接•真核mRNA前体的剪接•真核mRNA前体的选择性剪接•RNA的编辑主要内容transcription（一）概述•以DNA为模板合成RNA的过程。转录和DNA复制的区别Template(模板)•模板链(templatestrand)：反义链(anti-sensestrand)•非模板链(non-templatestrand):编码链(codingstrand),有意义链(sensestrand)•differentgenesmayusedifferentstrandsastemplate（二）原核生物RNA聚合酶E.coliRNA聚合酶全酶(holoenzyme)：α2β’σ核心酶(coreenzyme)：α2β’DNA指导的RNA聚合酶DNAdependentRNApolymerase(DDRP)β’αασcoreenzyme细菌中单一类型的RNA聚合酶负责合成所有的RNA。利用SDS-PAGE从E.coliRNA聚合酶中分离各个亚基亚基基因分子量(kD)数目功能αrpoA402酶的装配，与启动子上游元件及活化因子结合βrpoB1501结合底物，催化磷酸二脂键形成β’rpoC1601结合DNA模板σrpoD32-901识别启动子，促进转录起始ω9未知σ因子的结构σ70因子的一级结构σ因子与启动子的特异性相互作用E.coli与枯草杆菌各的σ因子同源区结合核心酶后（三）转录过程promoterterminatorStartpoint+10+20downstream+1upstream-35-10–1transcribedregion1.templaterecognition（模板的识别）2.Initiation(起始)3.elongation(延伸)4.termination（终止）原核生物转录过程启动子（promoter）：RNA聚合酶识别，结合并开始转录的一段DNA序列。模板的识别转录起始位点-35序列-10序列TTGACATATAAT五种不同启动子的共同顺序箭头表示突变，向上表示增加转录水平，向下表示降低转录水平提供RNA聚合酶识别信号有助于DNA局部双链解开σ因子对RNA聚合酶与DNA结合的影响σ因子使RNApol特异性的识别启动子σ因子的更替可控制转录起始转录的起始•RNA链的合成方向5′→3′转录的延伸σ循环:RNA聚合酶与启动子结合,使DNA局部熔解,当转录延伸时,σ因子与核心酶分离,与其它新的核心酶结合,起始新的转录事件.转录的终止终止子（terminator）：提供终止信号的DNA序列。E.coli有两类不依赖ρ因子的终止子:依赖于ρ因子的终止子不依赖ρ因子的终止子:•简单终止子，又称内在终止子（Intrinsicterminator）•转录终止不依赖任何辅助因子。而依靠转录产物形成特殊的茎环二级结构具有茎环结构•有茎环结构，富含GC•茎环结构后有寡聚尿苷依赖ρ因子的终止子（rho-dependentterminators）穷追(Hotpursuit)模型•通读(read-through)：某些因子可使酶越过终止子继续转录。•抗终止因子(anti-terminationfactor)：引起抗终止作用的蛋白质。•常见于某些噬菌体的时序控制通读•典型的真核细胞转录产物是单顺反子mRNA（四）真核生物转录特点真核DNAPAPBPC转录mRNAABC原核DNAABCP转录mRNAABC•真核细胞转录和翻译在时间上和空间上都是分开的，转录在细胞核，翻译在细胞质。•真核细胞RNApol高度分工•启动子更复杂和更多样性，不同的RNA聚合酶有不同的启动子•真核生物转录需要许多转录因子(transcriptionfactor,TF）的参与。•真核基因DNA的顺式作用元件比原核复杂得多•真核生物的转录调控以正调控为主。转录因子（transcriptionfactors）Definition:转录起始所需要的，而非RNA聚合酶本身组分的任何蛋白质•Functions:–BindingtoDNA–Recognizinganotherfactor–RecognizingRNAPol–Incorporatingintoinitiationcomplex转录因子（transcriptionfactors）转录因子（transcriptionfactors）Classification：普遍性转录因子：使RNA聚合酶结合到启动子上，形成前起始复合物。其作用相对较弱，仅在本底水平上支持转录并实施最小程度的调控。又称通用因子转录调控因子：通过与启动子及增强子等调控元件结合而调控转录活性的蛋白因子包括上游因子和可诱导因子是在所有启动子的RNA合成中都是必需的。是能够识别并结合转录起始位点上游的特异性短序列的DNA结合蛋白。普遍存在，且活性不被调控。在特定的时间或特定的组织被激活或合成，能控制转录在特定的时间和地点进行的一类因子。通用因子(Generalfactor)上游因子(Upstreamfactor)可诱导因子(Induciblefactor)转录因子（transcriptionfactors）顺式作用元件（Cis-actingelements）Definition:指与基因表达调控相关、能够被调控蛋白特异性识别和结合的特异DNA序列。包括启动子、增强子，负调控元件等反式作用因子(Trans-actingfactors)Definition:指真核细胞内通过与顺式作用元件相互作用而调节基因转录活性的蛋白质因子。S1核酸酶图谱技术引物延伸法测定转录起点的方法（五）真核生物基因转录起始的几种研究方法1.S1核酸酶图谱技术5’mRNA3’3’5’S1探针5’3’3’5’S1核酸内切酶水解变性电泳5’mRNA3’3’5’S1探针5’mRNA3’3’5’逆转录延伸引物变性电泳2.引物延伸法•1.5’端缺失系列分析法:常用于测定哺乳动物基因调控区的上游边界研究顺式作用元件结构的方法5’端缺失系列分析法AB切割位点AB核酸外切酶CAB连接接头ABCAB切割位点B和C报告基因连接报告基因载体转化E.coli分离质粒DNA分别转染培养细胞通过报告基因产物的活性，以检测基因活化与上游调控区片段的关系2.接头扫描突变法•可以找出存在于基因转录起始位点和5’端边界之间的所有调控元件•方法的基础是构建一系列序列重叠的调控区突变体，每个突变体内各有一个短序列的核苷酸序列被打乱，•然后分别转染培养细胞，或微量注入爪蟾卵母细胞，并分析它们对报告基因的影响接头扫描突变法机制疱疹病毒胸苷激酶基因启动子的连接扫描突变（六）真核生物RNA聚合酶对α-鹅膏蕈碱的敏感性酶的种类中等敏感RNA聚合酶III敏感RNA聚合酶II不敏感RNA聚合酶I1.真核细胞的三类RNA聚合酶α-鹅膏蕈碱的结构鬼笔鹅膏菌是一种能产生α-鹅膏蕈碱的毒磨RNA聚合酶对α-鹅膏蕈碱的敏感性（核仁）（核质）U6snRNA,7SLRNA,7SKRNA老鼠肝脏细胞三类RNA聚合酶在离子交换层析中的分离RNA聚合酶I定位于核仁RNA聚合酶II和III定位于核质EukaryoticRNApolIIhas10subunits2.RNA聚合酶II酵母RNA聚合酶II有12个亚基核心亚基：Rpb1、Rpb2和Rpb3共同亚基：Rpb5、6、8、12存在于所有三类RNA聚合酶中非必要亚基：Rpb4、7RNA聚合酶II最大亚基的异质性•CTD:carboxylterminaldomain（C末端结构域）•Aminoacidsequence:–—Tyr—Ser—Pro—Thr—Ser—Pro—Ser—•Targetforkinase•Function:triggerinitiation老鼠浆细胞RNApolII部分亚基结构o、a、b是最大亚基的三种形式与酵母的RNApolII的Rpb1相对应c是与酵母的Rpb2相对应RNApolII最大亚基不同形式间的相互关系IIa是CTD未被磷酸化的形式，主要负责转录的起始IIo是CTD被磷酸化的形式，主要负责转录的延伸IIb是被蛋白酶消化而失去CTD的形式thecrystalstructureofRNApolymeraseIIfromyeast（七）真核生物基因的启动子及转录起始复合物的组装•类型I启动子•类型II启动子•类型III启动子类型II启动子基本启动子(basalpromotor)转录起始位点(initiationsite,Inr)上游元件(upstreamelements)下游元件(downstreamelements)核心启动子(corepromotor)启动子近侧序列元件上游元件下游元件•序列名称位置序列反式作用因子•TATA-box-25~–30TATAAAATBP作用是确定精确的转录起始位点，而不起调节转录效率的功能基本启动子(basalpromotor)•序列名称位置序列反式作用因子•CCAAT-box-75~-80GGCCAATCTCTF、C/EBP•GC-box-90GGGCGGsp1上游元件(upstreamelements)常表现出细胞类型特异性，功能主要是提高转录的效率和特异性•类型II启动子在转录起始位点周围有保守的序列，是最适表达所需要的。•共同序列为PyPyANT（Py为嘧啶，N为任意碱基）转录起始位点(initiationsite,Inr)Howdoesapre-initiationcomplexform?•TBP：特异性地结合TATAbox•TAFⅡ：多亚基，是各种转录因子的靶位点FunctionsofTFⅡXTFⅡDTBP(TATA-bindingprotein)（TATA框结合蛋白）TAFⅡ(TBP-associatedfactors)(TBP偶联因子)(8-10)X=A,B,D,E,F,H…formationofplatform•TFⅡA:激活TBP，促进TFⅡD结合于TATAbox•TFⅡB:结合于TFⅡD-DNA上，确定转录起始位点，在TFⅡF协同下募集RNApolⅡ•TFⅡF:与RNApolⅡ结合，抑制RNApolⅡ与DNA的非特异性结合•TFⅡH：ATPase,helicase，kinase•TFⅡE：促进TFⅡH的激酶活性FunctionsofTFⅡXAssemblyofpre-initiationcomplex(PIC)转录前起始复合物DABPolF复合物形成的模型聚合酶是结合在TFⅡD，A和B结合位点（TATAbox）下游的DNA上RNAPolⅡisactivatedbyCTDphosphorylationCTD磷酸化后，使CTD中羟基电荷和结构发生变化，影响它与TBP结合的稳定性，使聚合酶从启动子上脱离TFⅡDTFⅡFRNAPolⅡTFⅡHPiDNARNATFⅡBTFⅡA通用转录因子参与转录起始、启动子清除、延伸的模型a.TBP或TFⅡD，同B、F及聚合酶II形成最基本的起始复合物添加TFⅡE和H，水解ATP使DNA在起始区解链，CTD部分磷酸化，产生流产转录物，很快停止。b.随着ATP提供能量，TFⅡH使DNA进一步解螺旋并使启动子清空c.CTD进一步磷酸化,NTP不断添加,延伸复合物不断进行RNA的延伸TBP和TFⅡDB仍留在启动子上，延伸不需要TFⅡE和H，从延伸复合物解离下来•TFIID中包括至少8种TBP偶联因子,分子量为30—250kD,分别命名为TAFⅡ-30～250•TAFⅡ150识别起始子(1nr)序列•TAF是基因转录调控的辅助因子，为各种调控因子提供作用的靶位点•它的作用是将上游调控区和远端调控区结合的转录调控因子与PIC联系在一起，而介导各种反式作用因子对基础转录的调控